표적 플라스미드 DNA 전달을 위한 메티오닌 기능화 생체 적합성 블록 공중합체
Summary
이 작품은 가역적 첨가 단편화 사슬 전달(RAFT) 방법을 통해 메티오닌 기능화된 생체 적합성 블록 공중합체(mBG)의 제조를 제시한다. 얻어진 mBG및 이들의 형질감염 효율의 플라스미드 DNA 복합성도 조사되었다. RAFT 방법은 특수 작용기 포함 단량체를 중합하는 데 매우 유용합니다.
Abstract
가역적 첨가-단편화 사슬 전달(RAFT) 중합은 라디칼 중합 및 살아있는 중합의 장점을 통합합니다. 이 작품은 RAFT 중합을 통해 메티오닌 기능화 생체 적합성 블록 공중합체의 준비를 제시한다. 첫째,N,N-비스(2-하이드록세틸)메타크릴라미드-b-N-(3-아미노프로필) 메타크릴라미드(BNHEMA-b-APMA, BA)를 사용하여 래프트 중합을 통해 합성하였다 4,4′-아조비스(4-시안발산)(ACVA)로 체인 전달제로서 개시제 및 4-시안펜타노산 디티오벤조에이트(CTP)를 개시한다. 이어서,N,N-비스(2-hydroxyethyl)메타크릴라미드-b-N-(3-guanidinopropyl) 메타크릴라미드(메티오닌 접목BNHEMA-b-GPMA, mBG)는 메티오닌 및 과니딘과 함께 APMA에서 아민 군을 변형시킴으로써 제조하였다. 그룹. 3종의 블록 폴리머, mBG1, mBG2 및 mBG3의 3가지 블록을 비교하기 위해 합성되었다. Ninhydrin 반응은 APMA 함량을 정량화하기 위하여 이용되었습니다; mBG1, mBG2 및 mBG3는 각각 21%, 37%, 52%의 APMA를 가졌다. 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 결과는 BA 공중합체가 16,200(BA1), 20,900(BA2) 및 27,200(BA3) g/mol의 분자량을 가지고 있음을 보여주었다. 수득된 블록 공중합체 유전자 운반체의 플라스미드 DNA(pDNA) 복합성 도 조사되었다. 전하비(N/P)는 pDNA가 mBG1, mBG2, mBG3으로 완전히 복합화되었을 때 8, 16 및 4였습니다. mBG/pDNA 폴리플렉스의 N/P 비율이 1보다 높았을 때, mBG의 제타 전위는 양수였다. 16과 32 사이의 N/P 비율에서 mBG/pDNA 폴리펙스의 평균 입자 크기는 100-200 nm 사이였습니다. 전반적으로, 이 작업은 블록 공중합체 반송파 합성을 위한 간단하고 편리한 프로토콜을 나타낸다.
Introduction
최근에는 모든 종류의 질병을 치료하는 약물로서 핵산의 치료적 전달을 위한 유전자 요법이 등장하고있다1. 플라스미드 DNA(pDNA) 및 소형 간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 유전자 약물의 개발은 약물 전달 시스템(DDS)2의안정성 및 효율성에 의존한다. 모든 DDS 중에서, 양이온 성 중합체 담체는 양호한 안정성, 낮은 면역원성 및 허수제 및 변형의 장점을 가지고 있으며, 이는 양이온 성 중합체 담체광범위한 응용 적 전망3,4를준다. 생물 의학에서 실용적인 응용을 위해, 연구원은 높은 효율, 낮은 독성 및 좋은 표적화 능력5를가진 양이온 폴리머 캐리어를 찾아야 합니다. 모든 폴리머 캐리어 중에서 블록 공중합체는 가장 널리 사용되는 약물 전달 시스템 중 하나입니다. 블록 공중합체는 약물 전달에서 미셀, 마이크로스피어 및 나노입자를 형성하는 자기 조립특성 및 능력에 대해 집중적으로 연구된다 5. 블록 공중합체는 살아있는 중합 또는 클릭 화학 방법을 통해 합성될 수 있습니다.
1956 년, Szwarc 등은 살아있는 중합의 주제를 제기, 연쇄 파괴 반응없이 반응으로 정의6,7. 그 이후로, 이 방법을 사용하여 중합체를 합성하기 위해 여러 기술이 개발되었다; 따라서, 살아있는 중합은 폴리머 과학8의 이정표로 간주됩니다. 살아있는 중합체는 살아있는 음이온 중합, 살아있는 양이온 중합, 및 가역적 불활성화 라디칼 중합(RDRP) 9로 분류될 수있다. 살아있는 이온/양이온 중합은 그들의 엄격한 반응 조건10으로인해 제한된 적용 범위를 가지는다. 제어/살아있는 라디칼 중합(CRP)은 온화한 반응 조건, 편리한 처리량 및 양호한 수율을 가지며, 따라서 최근 몇 년 동안 주요 연구 초점이 되었다11. CRP에서, 활성 전파 사슬은 자유 라디칼의 농도를 감소시키고 전파 사슬 라디칼의 이중 분자 반응을 피하기 위해 휴면 으로 가역적으로 전달됩니다. 추가 된 중합은 비활성 휴면 전파 사슬이 가역적으로 사슬 라디칼로 애니메이션되는 경우에만 계속할 수 있습니다. 살아있는 라디칼 중합의 가장 유망한 형태 중 하나로서, 가역적 첨가 단편화 사슬 전달 (RAFT) 중합은 조절 된 분자량과 구조, 좁은 분자량을 가진 블록 폴리머를 항복시키는 방법에 적용 가능한 방법입니다. [1] 및 운반기능군12. 성공적인 RAFT 중합의 핵심은 매우 높은 사슬 전달 상수를 보유한 체인 전달제( 일반적으로 디티오에스테르)의 효과입니다.
이 논문에서, 뗏목 중합 방법은 BNHEMA-b-APMA 블록 폴리머를 제조하도록 설계되었으며, 4,4′-아조비스(4-시안산)(ACVA)를 개시제및 4-시안펜타노산 디티오벤조에이트(CTP)를 사슬 전달제로 복용하였다. RAFT 중합은 BNHEMA를 양이온 성 중합체 담체 내로 도입하기 위해 두 번 사용되었습니다. 이어서, APMA 사슬내의 아민 기는 메티오닌 및 구니디닐화 시약 1-아미디노피라졸 염산염으로 변형되었다. 구니디닐화 시약 및 메타크릴아미드 폴리머 골격 구조의 양전하를 이용하여, 얻어진 블록 폴리머 담체의 세포 섭취 효율이 향상되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 일련의 BNHEMA-b-APMA 블록 폴리머 양이온 유전자 운반체를 소개하였다. 이들 블록 중합체는 가역적 첨가-단편화 사슬 전달(RAFT) 방법을 통해 합성되었다. 친수성 세그먼트 BNHEMA는 용해도를 향상시키기 위하여 소개되었습니다. 메티오닌 및 구아니딘 기는 표적 능력 및 형질감염 효율을 향상시키기 위해 수정되었다5. MBG 공중합체에서 APMA 사슬 함량이 증가하고 관과이니디?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (No. 2016YFC0905900), 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81801827, 81872365), 장쑤성의 기초 연구 프로그램 (자연 과학 재단, 아니. BK20181086) 및 강수암병원 과학연구기금(No. ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
