Methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren voor gerichte plasmide DNA-levering
Summary
Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren (mBG) via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. De plasmide DNA-complexering van het verkregen mBG en hun transfectie efficiëntie werden ook onderzocht. De RAFT methode is zeer gunstig voor polymerisatie monomeren met speciale functionele groepen.
Abstract
Omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht (RAFT) polymerisatie integreert de voordelen van radicale polymerisatie en levende polymerisatie. Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren via RAFT polymerisatie. Ten eerste, n, n–bis(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b–N-(3-AMINOPROPYL) methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) werd gesynthetiseerd via RAFT polymerisatie met 4, 4 ‘-AZOBIS (4-cyanovalerische zuur) (acva) als een initiërende agent en 4-cyanopentanoïnezuur dithiobenzoaat (CTP) als de keten transfer agent. Vervolgens, n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b–N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide (methionine geënt bnhema-b-gpma, mbg) werd bereid door het wijzigen van Amine groepen in APMA met methionine en guanidine Groepen. Drie soorten blok polymeren, mBG1, mBG2 en mBG3, werden gesynthetiseerd ter vergelijking. Een ninhydrine-reactie werd gebruikt om het APMA-gehalte te kwantificeren; mBG1, mBG2 en mBG3 hadden respectievelijk 21%, 37% en 52% van de APMA. De resultaten van de gelpermeatiechromatografie (GPC) toonden aan dat BA-copolymeren molecuulgewichten bezitten van 16.200 (BA1), 20900 (BA2) en 27200 (BA3) g/mol. Het plasmide DNA (pDNA) complexvormende vermogen van het verkregen blokcopolymeer gendragers werd ook onderzocht. De charge ratio’s (N/P) waren 8, 16 en 4 toen pDNA volledig werd aangevuld met respectievelijk mBG1, mBG2, mBG3. Toen de N/P ratio van mBG/pDNA polyplexen hoger was dan 1, was de Zeta-potentiaal van mBG positief. Bij een N/P-verhouding tussen 16 en 32 bedroeg de gemiddelde deeltjesgrootte van mBG/pDNA-polyplexen tussen 100-200 nm. Over het algemeen illustreert dit werk een eenvoudig en handig protocol voor de copolymeer Carrier synthese van Block.
Introduction
In de afgelopen jaren is gentherapie ontstaan voor de therapeutische afgifte van nucleïnezuren als geneesmiddelen voor de behandeling van allerlei ziekten1. De ontwikkeling van gengenees middelen, waaronder plasmide DNA (pDNA) en klein interfererende RNA (siRNA), is afhankelijk van de stabiliteit en efficiëntie van het geneesmiddel bezorgingssysteem (DDS)2. Onder alle DDS, kationische polymeer dragers hebben de voordelen van goede stabiliteit, lage immunogeniciteit, en facile voorbereiding en modificatie, die kationische polymeer dragers brede toepassing prospects3,4geven. Voor praktische toepassingen in de biomedische, onderzoekers moeten een kationische Polymer Carrier met hoge efficiëntie te vinden, lage toxiciteit, en goede targeting vermogen5. Onder alle polymeer dragers, Block copolymeren zijn een van de meest gebruikte drug delivery systemen. Block copolymeren worden intensief bestudeerd voor hun zelf-assemblage eigendom en capaciteiten om micellen, microsferen en nanodeeltjes te vormen in de levering van geneesmiddelen5. Blok copolymeren kunnen worden gesynthetiseerd via levende polymerisatie of klik op scheikunde methoden.
In 1956, szwarc et al. verhoogde het onderwerp van levende polymerisatie, definiëren het als een reactie zonder keten-brekende reacties6,7. Sindsdien zijn er meerdere technieken ontwikkeld om polymeren te synthetiseren met behulp van deze methode; levende polymerisatie wordt dus gezien als een mijlpaal van polymeer wetenschappen8. Levende polymerisatie kan worden ingedeeld in levende anionische polymerisatie, levende cationische polymerisatie en omkeerbare deactivering radicale polymerisatie (RDRP)9. Levende anionische/kationische polymerisaties hebben een beperkt toepassingsgebied vanwege hun strenge reactieomstandigheden10. Gecontroleerd/levend radicaal polymerisatie (CRP) heeft milde reactieomstandigheden, handige dispositie, en goede opbrengst en is dus een belangrijke onderzoeksinfrastructuur geweest in de afgelopen jaren11. In CRP worden actieve propagatie ketens reversibel gepassiveerde tot slapende om de concentratie van vrije radicalen te verminderen en de bimoleculaire reactie van voortplantings keten radicalen te voorkomen. De additie polymerisatie kan alleen worden voortgezet als de inactieve teelt ketens omkeerbaar worden geanimeerd in keten radicalen. Als een van de meest veelbelovende vormen van levend radicaal polymerisatie, omkeerbare toevoeging-fragmentatie ketting overdracht (RAFT) polymerisatie is een methode die van toepassing is op het rendements blok polymeren met gecontroleerd moleculair gewicht en structuur, smal moleculair gewicht distributie en het meenemen van functionele groepen12. De sleutel tot succesvolle RAFT polymerisatie is het effect van keten Transfer agenten, meestal dithioesters, die zeer hoge keten overdracht constante bezitten.
In dit document is een RAFT-polymerisatie methode ontworpen om BNHEMA-b-APMA-blok-polymeer te bereiden, waarbij 4, 4 ‘-azobis (4-cyanovalerische zuur) (acva) als initiërende middel en 4-cyanopentanozuurdithiobenzoaat (CTP) als keten transfer agent wordt gebruikt. RAFT polymerisatie werd twee keer gebruikt om BNHEMA in de cationische polymeer dragers te introduceren. Vervolgens werden de amine groepen in de APMA-keten gemodificeerd met methionine en de guanidinylatie-reagens 1-amidinopyrazol hydrochloride. Door het gebruik van de positieve ladingen van het guanidinylatiereagens en de methacrylamide polymeerskelet structuur werd de cellulaire opname-efficiëntie van de verkregen blok polymeer dragers verbeterd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie introduceerde een reeks BNHEMA-b-APMA blok polymeer cationische gendragers. Deze blok polymeren werden gesynthetiseerd via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. Het hydrofiele segment BNHEMA werd geïntroduceerd om de oplosbaarheid te verbeteren. Methionine en guanidine groepen werden aangepast ter verbetering van het doelvermogen en transfectie efficiëntie5. De APMA-keten-inhoud verhoogd en guanidinylering in mBG copolymeer verminderde de deeltjesgrootte …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door het National Key Research and Development Program van China (No. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation of China (NOS. 81801827, 81872365), basis onderzoeksprogramma van Jiangsu Province (Natural Science Foundation, No. BK20181086), en het Jiangsu Cancer Hospital wetenschappelijk onderzoek Fonds (nr. ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
