Metionin Funksjonalisert biokompatible Block Kopolymerer for målrettet plasmider DNA levering
Summary
Dette arbeidet presenterer utarbeidelse av metionin funksjonalisert biokompatible Block kopolymerer (mBG) via reversibel tillegg fragmentering kjeden Transfer (RAFT) metoden. Plasmider DNA-kompleks evne til den oppnådde mBG og deres transfeksjoner effektivitet ble også undersøkt. FLÅTEN metoden er svært gunstig for lysherde monomerer inneholder spesielle funksjonelle grupper.
Abstract
Reversibel tillegg-fragmentering kjede overføring (RAFT) polymerisering integrerer fordelene av radikale polymerisering og levende polymerisering. Dette arbeidet presenterer utarbeidelse av metionin funksjonalisert biokompatible blokk kopolymerer via RAFT polymerisering. For det første, n, n–BIS(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b–N-(3-aminopropyl) METHACRYLAMIDE (BNHEMA-b-APMA, ba) ble syntetisert via flåte polymerisering ved bruk av 4, 4 ‘-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) som en og 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) som kjede overføringsagenten. Senere, n, n-BIS(2-hydroxyethyl) methacrylamide-b–N-(3-GUANIDINOPROPYL) methacrylamide (metionin podet BNHEMA-b-GPMA, mBG) ble utarbeidet ved å endre Amin grupper i APMA med metionin og guaniniumtiocyanat Grupper. Tre typer blokk polymerer, mBG1, mBG2, og mBG3, ble syntetisert for sammenligning. En ninhydrin reaksjon ble brukt til å kvantifisere APMA-innholdet; mBG1, mBG2 og mBG3 hadde henholdsvis 21%, 37% og 52% av APMA. Gel gjennomtrengning kromatografi (GPC) resultater viste at BA kopolymerer ha molekylære vekter på 16 200 (BA1), 20900 (BA2), og 27200 (BA3) g/mol. Den plasmider DNA (pDNA) kompleks evne til de oppnådde blokk kopolymer gen bærere ble også undersøkt. Lade forholdene (N/P) var 8, 16 og 4 da pDNA ble complexed helt med mBG1, mBG2, mBG3, henholdsvis. Når N/P-forholdet mellom mBG/pDNA polyplexes var høyere enn 1, var Zeta-potensialet i mBG positiv. Ved et N/P-forhold mellom 16 og 32 var den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen på mBG/pDNA-polyplexes mellom 100-200 NM. Samlet sett illustrerer dette arbeidet en enkel og praktisk protokoll for blokken kopolymer carrier syntese.
Introduction
I de senere årene har genterapi dukket opp for terapeutisk levering av nukleinsyre syrer som medikamenter for å behandle alle typer sykdommer1. Utviklingen av gen stoffer, inkludert plasmider DNA (pDNA) og små forstyrrende RNA (siRNA), er avhengig av stabiliteten og effektiviteten til legemiddel leveringssystemet (DDS)2. Blant alle DDS, kationiske polymer bærere har fordelene med god stabilitet, lav immunogenisitet, og facile forberedelse og modifikasjon, som gir kationiske polymer bærere bred søknad utsiktene3,4. For praktisk bruk i biomedisin, må forskerne finne en kationiske polymer carrier med høy effektivitet, lav toksisitet, og god målretting evne5. Blant alle polymer bærere, blokk kopolymerer er en av de mest brukte stoffet leveringssystemer. Block kopolymerer er intensivt studert for sin selv montering eiendom og evner til å danne miceller, mikrosfærer, og nanopartikler i stoffet levering5. Block kopolymerer kan være syntetisert via levende polymerisering eller klikk kjemi metoder.
I 1956, Szwarc et al. hevet temaet levende polymerisering, definere det som en reaksjon uten kjede-Breaking reaksjoner6,7. Siden da har flere teknikker blitt utviklet for å syntetisere polymerer ved hjelp av denne metoden; Dermed er levende polymerisering sett på som en milepæl av polymer vitenskap8. Levende polymerisering kan klassifiseres i levende anioniske polymerisering, levende kationiske polymerisering, og reversibel deaktivering radikal polymerisering (RDRP)9. Living anioniske/kationiske polymerisasjoner har et begrenset anvendelsesområde på grunn av deres strenge reaksjonsforhold10. Kontrollert/levende radikale polymerisering (CRP) har milde reaksjonsbetingelser, praktisk disposisjon, og god avkastning og har dermed vært en stor forsknings fokus de siste årene11. I CRP, aktive forplantning kjeder er reverserbart paddivert i sovende seg å redusere konsentrasjonen av frie radikaler og unngå bimolecular reaksjonen av spre kjeden radikaler. Den tillegg polymerisering kan fortsette bare hvis inaktive sovende overføre kjeder er reverserbart animert i kjeden radikaler. Som en av de mest lovende former for levende radikale polymerisering, reversibel tillegg-fragmentering kjede overføring (RAFT) polymerisering er en metode som gjelder for å gi blokkere polymerer med kontrollert molekylvekt og struktur, smal molekylvekt distribusjon og gjennomføring av funksjonsgrupper12. Nøkkelen til vellykket flåte polymerisering er effekten av kjede overførings midler, vanligvis dithioesters, som har svært høy kjede overføring konstant.
I dette papiret ble en flåte polymerisering metode designet for å forberede BNHEMA-b-APMA Block polymer, tar 4, 4 ‘-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) som en igangsetting agent og 4-cyanopentanoic acid DITHIOBENZOATE (CTP) som en kjede overføring agent. RAFT polymerisering ble brukt to ganger for å innføre BNHEMA i kationiske polymer bærere. Deretter ble Amin gruppene i APMA-kjeden modifisert med metionin og guanidinylation reagens 1-amidinopyrazole-hydrochloride. Å gjøre bruk av positive anklager om guanidinylation reagens og methacrylamide polymer skjelett struktur, mobilnettet opptaket effektiviteten av de oppnådde blokken polymer bærere ble forbedret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien introduserte en rekke BNHEMA-b-APMA blokk polymer kationiske gen bærere. Disse blokk polymerer ble syntetisert via reversibel tillegg-fragmentering kjede overføring (RAFT)-metoden. Det hydrofile segmentet BNHEMA ble innført for å forbedre løselighet. Metionin og guaniniumtiocyanat grupper ble modifisert for å forbedre målet evne og transfeksjoner effektivitet5. APMA kjede innhold økte og guanidinylation i mBG-kopolymer reduserte partikkelstørrelsen til mBG/pDNA-polyplexes. P…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av den nasjonale nøkkel forskning og utviklings program i Kina (nr. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation i Kina (NOS 81801827, 81872365), Basic Research program av Jiangsu Province (Natural Science Foundation, nr. BK20181086), og Jiangsu Cancer Hospital Scientific Research Fund (nr. ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
