Os mecanismos subjacentes a secreção do hormônio Gut usando o isolado perfundido intestino de rato
Summary
Aqui, apresentamos um modelo poderoso e fisiológico para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à secreção de hormônio do intestino e a absorção intestinal — intestino isolado perfundido de rato.
Abstract
A barriga é o maior órgão endócrino do organismo, produzindo mais de 15 diferentes peptídeo hormônios que regulam o apetite e alimentar a ingestão, digestão, absorção de nutrientes e distribuição e excursões de glicose pós-prandial. Compreender os mecanismos moleculares que regulam a secreção de hormônio do intestino é fundamental para compreender e traduzir a fisiologia de hormônio do intestino. Tradicionalmente, os mecanismos subjacentes a secreção de hormônio do intestino também são estudados in vivo (em animais ou seres humanos) ou usando primária secretoras de hormônio gut mucosal culturas de células ou linhas de células. Aqui, apresentamos um intestino de rato perfundido isolado como um método alternativo para estudar a secreção de hormônio do intestino. As virtudes deste modelo são que ele depende do intestino intacto, significando que recapitula a maioria dos parâmetros fisiologicamente importantes responsáveis para o secretion em estudos in vivo, incluindo polarização da mucosa, relacionamentos parácrina e rotas de exposição de perfusão/estímulo. Além disso e ao contrário de estudos in vivo, o intestino de rato perfundido isolado permite quase completo controle experimental e avaliação direta da secreção. Em contraste com os estudos in vitro, é possível estudar tanto a magnitude e a dinâmica de secreção e para responder a perguntas importantes, tais como estímulos que causam a secreção de hormônios do intestino diferentes, de que lado do intestino (luminal ou vascular) é a secreção estimulada e analisar em sensores moleculares de detalhe subjacentes a resposta secretora. Além disso, a preparação é um poderoso modelo para o estudo da absorção intestinal e detalhes sobre a dinâmica de absorção intestinal, incluindo os transportadores responsáveis.
Introduction
A barriga é o maior órgão endócrino do organismo, produzindo mais de 15 diferentes peptídeo hormônios que regulam a absorção de nutrientes e disposição de nutrientes, crescimento intestinal e modulam o apetite1. Hormônios do intestino são, portanto, envolvidos em muitos processos fisiológicos fundamentais, e compreender estes padrões de secreção e os detalhes moleculares que controlam a secreção de hormônios respectivos, portanto, é importante para nossa basic fisiológica entendimento e para abordar aspectos translacionais das acções de hormônio do intestino; Mas como se pode estudar os mecanismos de detecção moleculares subjacente a secreção de hormônio do intestino? Em geral, a secreção do hormônio pode ser estudada em organismos intactos (humanos ou animais experimentais), de preparações isoladas do intestino ou de culturas de células primárias de secretoras de hormônio de intestino ou imortalizado célula culturas2,3, 4 , 5 , 6. nosso modelo preferido é o intestino delgado isolado perfundido de rato, que é um modelo fisiologicamente relevante que permite a secreção de hormônios do intestino a ser estudado em detalhe, com resolução de tempo ideal (secreção taxas podem ser determinadas a qualquer momento, base para o segundo), e os resultados são provavelmente transferível para uma situação em que vivo7. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre como executar este procedimento, mas primeiro vamos discutir outros métodos para estudar a secreção do hormônio do intestino, incluindo as vantagens e limitações desses modelos, em comparação com o intestino isolado perfundido de rato.
Se deseja estabelecer se um determinado composto regula a secreção de certos hormônios do intestino, estudos em humanos são o objetivo final. Assim, se um composto mostra grandes efeitos sobre a secreção de um ou vários hormônios do intestino em roedores (vivo ou perfusions) ou de hormônio secretoras células (linhas de célula ou células primárias), este efeito é apenas relevante em medicina e fisiologia humana se pode confirmar em seres humanos. No entanto, existem limites claros para o tipo de estudos que podem ser executadas em seres humanos, e estudos in vivo em animais experimentais são, portanto, muitas vezes a segunda melhor opção para esses estudos. Camundongos e ratos são os animais experimentais utilizados mais frequentemente presumivelmente devido ao seu tamanho conveniente, baixo custo e a opção de alterar geneticamente os genes suspeitados de estarem envolvidos em questões específicas do estudo (por exemplo, tirar um determinado transportador ou receptor). Em geral, modelos in vivo beneficiam sendo fisiologicamente intacto, mas também tem várias limitações. O mais importante, o tamanho pequeno de roedores, sobretudo ratos, é um fator limitante, como a maioria dos ensaios para quantificação de hormônio do intestino exigem pelo menos 20 µ l de plasma (e muitas vezes muito mais), o que significa que pelo menos 100 µ l de sangue tem que ser retirados para tornar um duplicado quantificação. Portanto, só é possível obter muito poucas amostras correspondentes às amostras de base e uma ou duas amostras pós-estimulação (o volume de sangue total em um rato de 20 g é ~1.4 mL). Por conseguinte, respostas secretoras potenciais (por exemplo, rapidamente ou respostas tarde-ocorrendo), portanto, pode ser perdida.
No modelo de perfusão, esse problema é superado, como amostra de grande volumes são obtidos (taxa de fluxo: 7,5 mL/min) e os intervalos de coleção podem ser ajustados conforme necessário para garantir que as respostas rápidas e de curta duração não são perdidas (nós recolher amostras de cada min)7 . Outro problema com estudos in vivo em roedores é que a maioria dos hormônios do intestino são ainda mais rapidamente eliminado ou metabolizada do que em seres humanos8,9,10, que pode complicar a análise bioquímica subsequente. Por exemplo, nós mostramos que o GLP-1 é metabolizado em ratos num ritmo ainda mais rápido do que em seres humanos (onde T1/2 é 1-2 min11) e, mais importante, que envolve a clivagem de GLP-1 em camundongos, além de clivagem do N-terminal por Dipeptidil-peptidase-4 (DPP4) (que é a enzima degradante de GLP-1 principal nos seres humanos), ainda mais a clivagem por enzima endopeptidase neutra 24,1112. Por conseguinte, atuais ensaios comerciais para a quantificação de GLP-1, que também são baseados no isoform intacta de GLP-1 (7-36amide) ou a isoforma de DPP-4 clivada (39amide-9), vastamente subestimam a secreção de GLP-1 em camundongos e resultam em enganosa resultados 12. no intestino delgado isolado perfundido de rato, a maioria do metabolismo dos hormônios secretados é eliminada ou marcadamente reduzida, desde que mediada por plasma degradação é evitada, e extração de fígado/rim/pulmão/degradação é impedida porque ( perfusato é recolhido assim que sai do intestino).
Claro, uma visão importante pode ser gerada pelo uso de animais geneticamente modificados, por exemplo,, de sódio-glicose transporte-1 nocaute ratos13, mas requer uma avaliação detalhada dos sensores moleculares envolvidos na secreção muitas vezes consideração de múltiplos sites moleculares, variando de transportadores moleculares de canais iônicos e de diferentes receptores G-proteína-acoplados a proteínas intracelulares. Por exemplo, escolhemos a atividade de nove diferentes sítios moleculares quando desvendar os sensores moleculares responsáveis pela secreção de GLP-1 glicose estimulada7. Um inquérito semelhante não seria possível em vivo como alguns dos compostos usados inespecíficas ou efeitos nocivos/letais. Por exemplo, quando usando o intestino perfundido, foi possível avaliar o papel do metabolismo da glicose intra celular para a secreção de GLP-1 e Neurotensina, bloqueando a formação de ATP com 2-4-dinitrofenol7,14 , bem como o papel de canais de cálcio dependentes de voltagem para ácidos biliares estimularam a secreção de GLP-1, NT e PYY3. Com efeito, a tetrodotoxina de bloqueador de canal de sódio altamente tóxico pode ser aplicada com sucesso em estudos de perfusão. Finalmente, no modelo de perfusão, pode ser diretamente avaliado onde no intestino um determinado composto estimula a secreção de um determinado hormônio, como o investigador pode simplesmente escolher e preparar a região desejada para perfundir, e ao mesmo tempo pode ser investigado se um estímulo causa secreção pela ativação dos sensores moleculares do lado luminal ou vascular do intestino,3,15,16.
Os mecanismos secretoras subjacente secreção do hormônio do intestino também pode ser estudada por usam pedaços de tecido do intestino (incluindo tecido humano), hormônio de culturas primárias intestinal (geralmente a partir de ratos), imortalizados secretando linhas celulares (de mouse ou de origem humana), por instinto tecido montada na câmara de Ussing ou pelo organoids (ambos mais frequentemente de ratos)2,3,4,5,6,17,18. Comparado a perfusions intestinais, estudos sobre pedaços de intestino humano, culturas de células primárias e linhagens celulares são tecnicamente mais fáceis de realizar e são uma maneira mais rápida e barata de gerar dados, mas claro, o estudo de pedaços de intestino requer acesso ao intestino humano fresco espécimes. No entanto, nestes modelos a polarização celular normal do intestino é inerentemente perdida, significando que estes modelos não podem ser usados para avaliar a ativação normal de sensores moleculares, e processos de absorção também não podem ser estudados. Além disso, esses estudos geralmente empregam a incubação do estática (para até vários h) que é altamente não-fisiológico e não tem nada a ver com a dinâmica de secreção normal das células, porque o produto secretado não é removido e assim gabarito pode influenciar o secreção de hormônios. Em contraste, no intestino perfundido, segregadas e absorvidas moléculas são eficientemente removidas pela microcirculação da mucosa como eles são em vivo, assegura a manutenção do Transmucoso gradientes para que absorção e secreção podem ocorrer a um ritmo normal. Além disso, culturas de células podem ter dedifferentiated de sua origem de células enteroendócrina nativo, significa que eles não são mais representante das células nativas em termos de conteúdo do peptide e expressão de sensores moleculares, embora eles ainda podem secretam o hormônio em questão. Isto é, por exemplo, o caso de GLP-1 linhas de célula segrega19.
É, portanto, nossa opinião de que as culturas de células primárias ou célula linha estudos são mais adequados para fins de triagem e para a realização de experiências de tipos que não podem ser realizados no vivo ou no intestino isolado perfundido. Por exemplo, uma verdadeira força das culturas de células primárias e culturas de linha celular é aquela secundária intra celular mensageiros (por exemplo, Ca2 +, acampamento, NAD(P)H) pode ser monitorado em tempo real, e sinalização eléctrica do hormônio secretoras células pode ser investigado de21,20,22. Além disso, siRNA nocaute pode ser feito, que é particularmente útil se inibidores específicos não estão disponíveis20,21,22,23,24. Tecido do intestino de ratos montado na câmara de Ussing recentemente tem sido usado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a secreção de ácidos biliares GLP-1 estimulada, enquanto organoids intestinal (de ratos) e pedaços de intestino humano também têm sido usados para estudar o detalhes moleculares do intestino a secreção de hormônio17,25. Considerando que os antigos benefícios de ser polarizado2 todos estes modelos envolvem incubação do estática. Estudos sobre pedaços de intestino humano, no entanto, beneficiam de tecido humano, ao invés de roedores, o que é importante, desde que a diferença de espécie na expressão tecidual dos receptores 7TM e transportadores moleculares podem resultar em diferentes caminhos de detecção moleculares entre espécies. Na verdade, a maioria dos dados nesse campo tem sido gerados por estudos em porcos, ratos ou ratos, e continua a ser evasivo se estes resultados podem ser transferidos para os seres humanos. É, no entanto, tranquilizando que os mecanismos de detecção moleculares subjacentes a glicose-estimulou a secreção de GLP-1 parecem ser semelhantes entre o rato, o rato, o homem, e transcriptomic e peptidomic de criação de perfil de rato e L-células humanas revelaram forte global semelhanças entre as duas espécies7,18,26,27.
O intestino de rato perfundido isolado, no entanto, também tem algumas limitações que devem ser consideradas. Mais importante, é impossível determinar se uma dada resposta secretora resulta da ativação direta pela substância das células produtoras de hormônio alvo ou melhor é causada por um mecanismo indireto. Por exemplo, KCl instantaneamente aumenta a secreção de GLP-1 do intestino perfundidos7, mas continua a ser desconhecido se isto é uma consequência da despolarização direta da L-célula ou resulta da despolarização de neurônios perto do L-células ou efeitos de lançado simultaneamente parácrina estimuladores/inibidores. Dados provenientes de estudos utilizando o intestino perfundido que visam elucidar os mecanismos moleculares subjacentes secreção devem, portanto, sempre ser colocados no contexto com dados obtidos de outros modelos mais específicos para aumentar a capacidade de estabelecer nexo de causalidade. Por exemplo, secreção de GLP-1 glicose-estimulada da linha celular secretando GLUTag28,29 de GLP-1 e do mouse principal L-células dependem da atividade dos transportadores de glicose (SGLT1 e GLUT2). Bloquear esses transportadores no intestino pequeno rato perfundido também atenua a secreção20, significa que é provável que glicose-estimulou a secreção de GLP-1 é em grande parte mediada por ações diretas de glicose na célula-L. Uma outra limitação importante do intestino isolado perfundido é que alguns dos lipídeos são difíceis de estudar devido a sua hidrofobicidade. Embora seja possível investigar os produtos finais da digestão de lipídios (ácidos graxos, diacil glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) e, embora a preparação pode ser capaz de re-esterificar os lipídios intra celularmente e talvez embalá-los em quilomícrons, o transporte dos quilomícrons fora das células e sua subsequente penetração pelos lacteals das vilosidades é interrompida, desde que o fluxo de linfa no intestino isolado não pode ser garantido. O mais provável, portanto, absorção de lipídios é interrompida quando os produtos absorvidos começam a acumular-se nas células. Os sistemas de células in vitro são ainda menos adequados para estudos de lipídios por causa de sua falta de polarização. Obviamente, esta limitação só é relevante para lipídios que são absorvidos e transportados através do lacteals, Considerando que aquelas absorveram através dos vasos sanguíneos intestinais são susceptível de ser tratado normalmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
O intestino delgado isolado perfundido de rato é uma ferramenta poderosa da pesquisa que permite a dinâmica e os mecanismos moleculares subjacentes a secreção de hormônio do intestino a ser estudado em detalhe. O passo mais crítico para o sucesso da produção de dados com este modelo é a operação cirúrgica. Manipulação do intestino irá inevitavelmente causar algum dano para o intestino e, portanto, deve ser mantida a um absoluto mínima. Ainda mais importante, a velocidade de operação é chave, particular…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma concessão irrestrita para Prof Jens Juul Holst do Novo Nordisk centro de pesquisa metabólica básica (Novo Nordisk Foundation, Dinamarca), uma concessão separada da Novo Nordisk Foundation para fazer estudos de perfusão roedores (conceder n. NNF15OC0016574), uma subvenção ao Prof Holst desde o Conselho Europeu de investigação (Grant no.695069) e a União Europeia é sétimo programa-quadro de investigação, TechnologicalDevelopment e actividades de demonstração (Grant no. 266408), bem como um pós-doutorado conceda a Rune E. Kuhre da Fundação Lundbeck (3492-R264-2017). Agradecemos a Jenna E. Hunt e Carolyn F. Deacon para revisão cuidadosa.
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
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