Лежащие в основе кишки гормона с помощью изолированных механизмов увлажненную крыса тонкой кишки
Summary
Здесь мы представляем мощный и физиологические модель для изучения молекулярных механизмов лежащие в основе гормона кишки и кишечной абсорбции — изолированной перфузии крыса тонкой кишки.
Abstract
Кишечник является крупнейшим эндокринных органов тела, производит более 15 различных пептидные гормоны, которые регулируют аппетит и приема пищи, пищеварения, всасывания питательных веществ и распределения и глюкозы натощак после экскурсии. Понимание молекулярных механизмов, которые регулируют секрецию гормона кишки имеет основополагающее значение для понимания и перевода гормон физиологии кишечника. Традиционно лежащие в основе кишки гормона либо изучаются in vivo (в экспериментальных животных или человека) или механизмы с использованием слизистой оболочки кишки секреции гормона начальных клеточные культуры или мобильных линий. Здесь мы представляем кишечник изолированной перфузии крыса как альтернативный метод для обучения гут гормона. Достоинства данной модели являются, что он опирается на нетронутыми кишечник, означает, что он резюмирует наиболее физиологически важных параметров, ответственных за секрецию в в-vivo исследований, включая слизистой поляризации, паракринными отношения и маршруты Перфузионный/стимул экспозиции. Кроме того и в отличие от в-vivo исследований изолированной перфузии крыса тонкой кишки позволяет почти полный контроль экспериментальных и прямой оценки секреции. В отличие от исследования in vitro он позволяет изучить масштабы и динамику секреции и на важные вопросы, например какие раздражители вызывают секрецию гормонов различных кишечник, с какой стороны кишечника (люминал или сосудистая) является секреции стимулирует и для анализа в деталях молекулярных сенсоров, лежащие в основе секреторная реакция. Кроме того подготовка является мощная модель для изучения кишечного поглощения и деталей относительно динамики кишечного поглощения, включая ответственность перевозчиков.
Introduction
Кишечник является крупнейшим эндокринных органов тела, производит более 15 различных пептидные гормоны, которые регулируют всасывание питательных веществ и утилизации питательных веществ, кишечные роста и модулировать аппетит1. Таким образом, кишечнике гормоны участвуют во многих основных физиологических процессах, и понимание этих моделей секреции и молекулярных детали, контролирующие секрецию гормонов, соответствующих таким образом важно для наших основных физиологических понимание и для решения трансляционная аспектов действия гормона кишки; но как одно исследование молекулярных механизмов зондирования лежащие в основе кишки гормона? В общем гормона можно изучать в нетронутыми организмов (людей или экспериментальных животных), от изолированных кишечнике препаратов или кишки секреции гормона начальных клеточных культур или увековечен клетки культуры2,3, 4 , 5 , 6. наши предпочтительной моделью является изолированной перфузии крыса тонкой кишки, который является физиологически соответствующую модель, которая позволяет секреции гормонов кишки необходимо изучить в деталях с оптимальным временем резолюции (секреции, ставки могут быть определены с любое время Базовый вплоть до второй), и результаты, вероятно, передаваемой в естественных условиях положение7. Здесь мы предоставляем подробный протокол о том, как выполнить эту процедуру, но сначала мы будем обсуждать другие методы для обучения гут гормона, включая преимущества и ограничения этих моделей, по сравнению с изолированной перфузии крыса тонкой кишки.
Если один хочет, чтобы установить ли конкретного соединения регулирует выделение гормонов, некоторых кишки, исследования в организме человека являются конечной целью. Таким образом если соединение показывает большое влияние на выделение одного или нескольких гормонов кишки в грызунов (в естественных условиях или орошений) или от гормон секретирующих клеток (линии клетки или клетки первичной), этот эффект относится только к медицине и физиологии человека если оно может быть подтверждено в организме человека. Однако существуют четкие ограничения для типов исследований, которые могут быть выполнены в организме человека, и в естественных условиях исследования на подопытных животных, таким образом, часто второй лучший вариант для таких исследований. Мыши и крысы являются наиболее часто используемые подопытных животных, предположительно, по причине их удобный размер, низкая стоимость и возможность генетически изменить гены, подозреваемых в участии в конкретные исследования вопросов (например, выбить из определенных автофургона или рецептор). В целом в естественных условиях модели выгоду от того физиологически нетронутыми, но также имеют несколько ограничений. Самое главное, небольшой размер грызунов, особенно мышей, является ограничивающим фактором, поскольку большинство анализов кишки гормон количественной оценки требуют по меньшей мере 20 мкл плазмы (и зачастую намного больше), что означает, что по крайней мере 100 мкл крови должен быть снят, чтобы сделать дубликат количественная оценка. Таким образом это возможно только для получения очень мало проб соответствующих базовых образцов и один или два после стимуляции (общего объема крови в мыши 20 g-~1.4 мл). Следовательно потенциальные секреторной ответы (например, быстро или поздно происходит ответов) поэтому могут быть пропущены.
В модели перфузии, преодолеть этот вопрос, как большой образец получаются томов (скорость потока: 7,5 мл/мин) и коллекции интервалы могут быть скорректированы, как необходимо для обеспечения не пропустили быстрый и недолго ответы (мы собирать образцы каждые мин)7 . Еще одна проблема с в vivo исследования на грызунах что большинство кишки гормоны являются даже более быстро ликвидированы или метаболизируется чем люди8,9,10, которая может затруднить последующее биохимический анализ. К примеру, мы показали, что GLP-1 метаболизируется в мышей еще более быстрыми темпами, чем в организме человека (где T1/2 -1-2 мин11) и, что более важно, что предполагает расщепления GLP-1 в мышей, в дополнение к N-терминальный расщепления по dipeptidyl пептидазой-4 (DPP4) (который является основных GLP-1 унижающее достоинство ферментов в организме человека), далее расщепления фермента нейтральной эндопептидазы 24.1112. Следовательно текущих коммерческих анализов для количественной оценки GLP-1, которые основаны либо на нетронутыми изоформы GLP-1 (7-36amide) или DPP-4 расщепляется изоформы (9-39amide), значительно недооценивать GLP-1 секреции у мышей и привести в заблуждение результаты 12. в тонком кишечнике изолированной перфузии крыса, большая часть метаболизм гормонов выделяется ликвидированы или заметно уменьшается, так как избежать плазмы опосредованной деградации, и функции печени/почек/легкого извлечения/деградации предотвращается (потому что perfusate собирается как листья кишечнике).
Конечно важно понимание могут быть получены путем использования генетически модифицированных животных, например, натрия глюкозы транспортер-1 нокаут мышей13, но подробной оценки молекулярных сенсоров, участвующих в секреции часто требует рассмотрение нескольких молекулярной сайтов, начиная от молекулярных транспортеры для ионных каналов и от разных сочетании с G-белком рецепторов внутриклеточные белки. Например мы ориентированы деятельность девяти различных молекулярных сайтов когда распутывая молекулярных сенсоров, ответственных за глюкозы стимулирует секрецию GLP-17. Подобные расследования не будет возможно в естественных условиях как некоторые из соединений, используемых неспецифическим или вредных/смертоносные последствия. Например при использовании перфузии кишечник, можно было оценить роль метаболизма глюкозы внутри сотовой за секрецию GLP-1 и neurotensin, блокируя образование АТФ с 2-4-динитрофенола7,14 , а также роли напряжение закрытый кальциевых каналов для желчных кислот стимулировали GLP-1, NT и PYY секреции3. Действительно Тетродотоксин блокатор канала высокотоксичных натрия может успешно применяться в перфузионные исследования. Наконец в перфузии модели она может непосредственно оценивать где в кишечнике определенные соединения стимулирует секрецию гормона, как следователь может просто выбрать и подготовить желаемый регион для perfuse, и в то же время она может быть исследована ли стимул вызывает секрецию активации молекулярные датчики со стороны Люминал или сосудов кишечника3,,1516.
Ею основных гормона кишки могут быть изучены также секреторную механизмов использования кусков ткани кишечника (включая тканей человека), гормон основной кишечных культур (обычно от мышей), увековечен секретирующих клеток линии (мышь или человеческого происхождения), в кишечнике ткани установлен в Ussing камерах или organoids (оба чаще всего от мышей)2,3,4,5,6,17,18. По сравнению с кишечных орошений, исследования на кишечнике человека штук, начальных клеточных культур и клеточных линий технически проще выполнять и быстрее и дешевле способ получения данных, но конечно исследование кишечника штук требуется доступ к свежей кишечнике человека образцы. Однако в этих моделях поляризации нормальной клетки кишечника теряется по сути, означает, что эти модели не могут использоваться для оценки нормального активации молекулярных сенсоров, и процессы абсорбциы также не могут быть изучены. Кроме того, такие исследования обычно используют статические инкубаций (для до нескольких h) которая очень не физиологические и имеет ничего общего с нормальной секреторной динамикой клетки, потому что выделяется продукт не удаляется, и таким образом может повлиять обратной связи секреция гормонов. Напротив в перфузии ЖКТ, секретируемые и поглощается молекулами эффективно удаляются слизистой микроциркуляции как они находятся в естественных условиях, обеспечение чресслизистого градиентов так поглощения и секреции может произойти с нормальной скоростью. Кроме того может dedifferentiated клеточных культур от их родной enteroendocrine ячеек происхождения, означает, что они больше не представитель родной клеток с точки зрения содержания пептида и проявление молекулярных сенсоров, хотя они могут по-прежнему выделяют гормон в вопросе. Это, например, в случае GLP-1 секреции клеток линии19.
Это, таким образом, наше мнение, что культуры главной ячейки или ячейки линии исследования наиболее подходят для скрининга целей и для выполнения типы экспериментов, которые не могут быть выполненной в естественных условиях или в изолированной перфузии кишечнике. Например, истинная сила первичного клеточных культур и культур клеток линии находится внутри клеточной среднее посыльных (например Ca2 +, лагерь, NAD(P)H) можно контролировать в режиме реального времени, и электрической сигнализации гормона, секретирующих клеток может быть расследование20,21,22. Кроме того сногсшибательно малых интерферирующих РНК может быть сделано, что особенно полезно, если специфичные ингибиторы не доступны20,21,22,,2324. Гут ткани от мышей, монтируется в Ussing камерах недавно был использован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе стимулировали GLP-1 секрецию желчных кислот, при кишечных organoids (от мышей) и кишечнике человека штук также были использованы для изучения молекулярные детали кишки гормональной секреции17,25. В то время как бывший выгоды от того, поляризованных2 все эти модели включают статические инкубаций. Исследования на куски в кишечнике человека, однако, извлечь выгоду из использования человеческих, а не грызун, ткани, которая имеет важное значение, поскольку видов разница в ткани экспрессии рецепторов 7TM и молекулярных перевозчиков может привести к различных молекулярных зондирования пути между видов. В самом деле большая часть данных в этой области был сформирован путем исследования на свиней, мышей или крыс, и она остается неуловимым ли эти выводы могут быть переданы для людей. Это, однако, обнадеживает, что молекулярные зондирования механизмы, которые лежат в основе глюкозы стимулирует секрецию GLP-1, как представляется, подобные между мыши, крысы, человек, и транскриптомики и peptidomic профилей мыши и L-клетки человека показал сильный глобальный сходство между двумя видами7,18,,2627.
Однако, изолированной перфузии крыса тонкой кишки, также имеет некоторые ограничения, которые должны быть рассмотрены. Самое главное невозможно определить, связана ли данный ответ секреторной результаты от прямой активации испытываемого вещества целевых гормон продуцирующих клеток или скорее косвенные механизмом. К примеру KCl мгновенно увеличивает секрецию GLP-1 от перфузии кишечника7, но она остается неизвестным, является ли это следствием прямого деполяризации клеток L или результатом деполяризации нейронов недалеко от L-клетки или эффекты одновременно выпустили паракринными стимуляторы/ингибиторов. Данных, вытекающих из исследований с использованием перфузии intestine с целью выяснения молекулярные механизмы лежащие в основе секрецию следует таким образом, всегда ставится в контекст с данными, полученными из других более конкретных моделей для повышения способности установить Причинность. К примеру глюкоза стимулирует секрецию GLP-1 от линии секреции ячейки GLP-1 GLUTag28,29 и от мыши L-клетки зависит от активности транспортеры глюкозы (SGLT1 и GLUT2). Блокирование этих перевозчиков в тонком кишечнике перфузии крыса также ослабляет секрецию20, что означает, что вполне вероятно, что глюкоза стимулирует секрецию GLP-1 значительной степени опосредовано прямого действия глюкозы на L-cell. Другим важным ограничением изолированной перфузии кишечника является, что некоторые из липидов, трудно учиться из-за их гидрофобность. Хотя это можно исследовать окончательные продукты переваривания липидов (жирные кислоты, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols и т.д.) и подготовка может иметь возможность повторно эстерифицировать липиды внутри cellularly и возможно упаковать их в хиломикроны, перевозки хиломикроны из клетки и их последующего поглощения lacteals Вилли нарушается, поскольку лимфотока в изолированных кишечник не может быть обеспечена. Скорее всего таким образом, липидов поглощения прекращается после всасывается продукты начинают накапливаться в клетках. В пробирке клеток системы даже меньше подходят для исследования липидов из-за их отсутствия поляризации. Очевидно это ограничение относится только к липиды, которые поглощаются и транспортируются через lacteals, тогда как те всасывается через кровеносные сосуды кишечника могут обрабатываться как правило.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тонкая кишка изолированной перфузии крыса является мощный исследовательский инструмент, который позволяет динамика и молекулярные механизмы лежащие в основе кишки гормонов необходимо изучить в деталях. Наиболее важным шагом для успешного производства данных с этой моделью является…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана неограниченный Грант Профессор Йенс Юуль холста от Ново Нордиск центра фундаментальных исследований метаболизма (Ново Нордиск фонд, Дания), отдельный грант от Ново Нордиск фонда для этого грызуна перфузионные исследования (Грант нет. NNF15OC0016574), Грант Профессор холста из Европейского исследовательского совета (Grant no.695069) и Европейского союза в седьмой рамочной программы научных исследований, TechnologicalDevelopment и демонстрационной деятельности (Грант № 266408), а также постдока Грант в Руне Kuhre E. Lundbeck фонда (R264-2017-3492). Мы благодарим Дженна E. Хант и Каролин F. склизки для тщательного корректуры.
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
- Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
- Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
- Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
- Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
- Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
- Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
- Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse?. Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
- Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
- Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
- Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
- Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
- Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
- Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
- Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
- Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
- Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
- Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
- Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
- Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
- Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).
- Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
- Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
- Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).
