Qui descriviamo un’analisi basata sulle celle per valutare quantitativamente l’assorbimento tau da microglia con l’obiettivo di creare uno strumento in fase di sperimentazione per caratterizzare meglio i meccanismi di azione degli anticorpi anti-tau.
Morbo di Alzheimer (annuncio) è una condizione neurodegenerativa progressiva in cui aggregati tau e dell’amiloide proteine si accumulano nel cervello che causano la disfunzione neuronale che finalmente conduce al declino conoscitivo. Aggregati di tau iperfosforilata nel neurone sono creduti per causare la maggior parte della patologia associata con l’annuncio. Questi aggregati sono assunto per essere rilasciato nel compartimento extracellulare e ripreso da neuroni sani adiacenti dove inducono ulteriore aggregazione tau. Questa diffusione “del prion-like” può essere interrotto dagli anticorpi in grado di legare e di “neutralizzare” aggregati extracellulare tau come mostrato nei modelli preclinici del topo dell’annuncio. Uno dei meccanismi proposti da cui gli anticorpi terapeutici riducono la patologia è anticorpo-mediato l’assorbimento e la clearance di forme patologiche aggregate di tau di microglia. Qui, descriviamo un dosaggio quantitativo basato a cellula per valutare l’assorbimento tau da microglia. Questo test utilizza la linea cellulare di topo microglial BV-2, permette di alta specificità, bassa variabilità e rendimento medio. I dati generati con questo test possono contribuire a una migliore caratterizzazione delle funzioni effettrici degli anticorpi anti-tau.
Morbo di Alzheimer (annuncio) è una condizione neurodegenerativa caratterizzata dal cambiamento conformazionale e auto-assemblaggio della proteina tau e del peptide amiloide β in aggregati patologici. Il peptide β amiloide solubile normale viene convertito in β amiloide oligomerici e fibrillare, mentre tau anormalmente fosforilata si accumula come oligomeri e grovigli neurofibrillary1,2. Questi aggregati di proteina causano morte neuronale che porta alla perdita di memoria e declino conoscitivo progressivo successivo. Altri fattori, tra cui non produttivi neuroinflammation e una ridotta capacità di eliminare le proteine misfolded, possono aggravare e accelerare la malattia. Attualmente, le strategie di intervento contro AD fornire sollievo sintomatico in gran parte, ma non ci è cura o prevenzione modificante la malattia.
La prova aumentante suggerisce un ruolo chiave degli aggregati di tau iperfosforilata in patologia dell’annuncio. Nel suo stato non patologico, tau è una nativo spiegata della proteina che si lega ai microtubuli e promuove il loro assemblaggio in del citoscheletro neuronale. Quando tau diventa hyperphosphorylated, esso si stacca dal citoscheletro e cluster in aggregati di tau nel neurone, che si credevano per causare la maggior parte della patologia associata AD3. Aggregate tau inizia ad accumulare prima intracellulare, ma come la malattia progredisce, si presume di essere rilasciato dai neuroni interessati nello spazio extracellulare, da cui possono essere presi dai neuroni sani adiacenti o sinapticamente connessi in un ” prione-come il modo”. Una volta interiorizzato, l’aggregato di tau induce ulteriore aggregazione tau via cambiamento conformazionale basato su modelli4.
Secondo questa ipotesi, terapie in grado di interrompere tau semina potrebbero rallentare o invertire il corso della malattia neurodegenerative tau-mediata. A sostegno di ciò, topi reso suscettibile di tauopathy da mutazione genetica e passivamente iniettato con gli anticorpi anti-tau mostrano ridotta taupatia e miglioramento della funzione cognitiva5,6,7,8 ,9. Tuttavia, i meccanismi da cui gli anticorpi terapeutici riducono patologia rimangono ancora sfuggenti.
Uno dei meccanismi proposti è l’assorbimento dell’anticorpo-mediata e la clearance di forme patologiche aggregate di tau da microglia, residente cellule immunitarie del cervello. Pubblicazioni recenti suggeriscono che il microglia in modo efficiente può interiorizzare e degradare specie patologiche tau e questa capacità è arricchita da anticorpi anti-tau tramite un Fc-dipendente meccanismo che coinvolge Fc recettori espressi sulla superficie di microglia e recettore mediata fagocitosi10,11. Questi dati per identificare microglia come potenzialmente importanti effettori di anticorpi terapeutici.
Descriviamo qui un’analisi basata sulle celle per valutare quantitativamente l’assorbimento tau da microglia. I dati generati con questo test possono aiutare a chiarire i meccanismi di azione degli anticorpi anti-tau, rappresentando così uno strumento utile per avanzare gli anticorpi anti-tau ulteriore procedura del loro sviluppo come trattamento potenziale AD.
Microglia, le cellule immunitarie del cervello residente, sono state recentemente identificate come giocatori importanti in anticorpo-mediato di approcci terapeutici per Taupatie10,11. Liquidazione di tau anticorpo-mediato da microglia, insieme al blocco di un neurone assorbimento9, inibizione o destabilizzazione della fibrilla formazione13,14 e clearance di fibrille intraneuronale via la lysosomal percorso15, potrebbe tutti contribuiscono all’efficacia dell’anticorpo anti-tau osservato nel modello del topo di tauopathy5,6,7,8,9.
Abbiamo descritto qui un’analisi basata sulle celle per valutare quantitativamente l’assorbimento tau da microglia con l’obiettivo di creare uno strumento in fase di sperimentazione per caratterizzare meglio i meccanismi di azione degli anticorpi anti-tau.
Questa analisi, adattata da Funk et al. 11, utilizza BV-2 cellule, che sono cellule microgliali murine immortalizzate. Mentre non possono completamente essere confrontati alle cellule microglial primarie, presentano molte delle caratteristiche della microglia primaria, inclusa la possibilità di robustamente fagocitare tau e Aβ fibrille11,16,17 ,18,19. Inoltre, hanno mostrato un comportamento riproducibile in vitro che li ha resi altamente adatto a sviluppo di analisi e studi quantitativi, che richiedono minima variabilità sperimentale. Accanto a questo, linee cellulari immortalizzate permettono un throughput più elevato dosaggio ed eliminano la necessità del sacrificio animale rispetto all’uso di microglia primaria.
Gli aggregati di tau che abbiamo usati per questo test sono stati ottenuti utilizzando la procedura altamente riproducibile in vitro aggregazione che abbiamo recentemente descritto13e visualizza accoppiato morfologia simile ai filamenti elicoidali (app) isolati dal cervello dell’annuncio pazienti. Mentre non abbiamo osservato alcun risultato imprevisto che potrebbe essere stato causato da tau aggregati aderenza alle superfici di plastica o di vetro, l’uso di aggregati stabili e ben caratterizzati tau ha svolto un ruolo cruciale nella riproducibilità di questo test.
Un altro aspetto che ha contribuito significativamente al riproducibilità del test è stata la densità delle cellule. I numeri delle cellule per pozzetto descritto nel protocollo rappresentano la densità cellulare ottimale nelle condizioni descritte.
In modo diverso rispetto a quello che Funk et al. 11 descritto, abbiamo etichettato aggregati di tau con un colorante sensibile di pH che aumenta notevolmente la sua fluorescenza all’interiorizzazione in organelli acidi, consentendo in tal modo quantificazione intracellulare. Questo, insieme a digestione della tripsina di superficie associato degli immunocomplessi e/o tau, garantisce quel segnale di fluorescenza misurata da citometria a flusso è il risultato di assorbimento di tau piuttosto che si legano alla superficie cellulare. Inoltre, l’uso di una facilita di colorante sensibile pH rilevamento degli aggregati di tau interiorizzata in esperimenti di microscopia senza il bisogno di digerire superficie associato aggregati di immunocomplessi/tau che avrebbero poi richiede cellula ri-placcatura e recupero.
Abbiamo ottimizzato ulteriormente la lettura di microscopia della nostra analisi, rispetto a che cosa precedentemente è stato descritto11, utilizzando un colorante altamente selettivo per acidi organelli nei nostri esperimenti di microscopia che ci ha permesso non solo di confermare anticorpo-mediata l’assorbimento di Tau, ma anche la localizzazione degli aggregati di tau nel compartimento endolisosomiale.
Il saggio che abbiamo sviluppato, ha specificità ottimale che si traduce in una buona finestra sperimentale che permette una netta separazione tra i campioni positivi e negativi. Interessante, l’analisi rileva indirettamente differenze nell’affinità dell’anticorpo, rappresentando così un potente strumento per studiare le funzioni effettrici degli anticorpi anti-tau.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Alberto Carpinteiro Soares per la sua preziosa assistenza tecnica.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |