Aqui nós descrevemos um baseada em célula de ensaio para avaliar quantitativamente a absorção de tau por microglia com o objectivo de criar uma ferramenta experimental para melhor caracterizar os mecanismos de ação dos anticorpos anti-tau.
A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa progressiva em que agregados tau e proteínas amiloides se acumulam no cérebro causando disfunção neuronal que eventualmente leva ao declínio cognitivo. Agregados de Hyperphosphorylated tau no neurônio são acreditados para causar a maioria da patologia associada com AD. Estes agregados são supor para ser lançado para o compartimento extracelular e retomados pelos neurônios saudáveis adjacentes onde eles mais induzem agregação de tau. Este “príon-como” espalhando pode ser interrompido por anticorpos capazes de vinculação e “neutralização” agregados extracelulares tau como mostrado em modelos pré-clínicos rato de AD. Um dos mecanismos propostos pelos quais anticorpos terapêuticos reduzem patologia é mediada por anticorpos de captação e apuramento das formas agregadas patológicas de tau por microglia. Aqui, descrevemos um ensaio quantitativo baseado em pilha para avaliar a absorção de tau por microglia. Este ensaio utiliza a linha de celular do rato microglial BV-2, permite alta especificidade, baixa variabilidade e taxa de transferência média. Dados gerados com este ensaio podem contribuir para uma melhor caracterização das funções efetoras de anticorpo anti-tau.
A doença de Alzheimer (AD) é uma condição neurodegenerativa progressiva caracterizada pela mudança conformacional e auto-montagem de proteína tau e peptídeo β amiloide em agregados patológicos. O peptídeo β amiloide solúvel normal é convertido em β amiloide oligoméricas e fibrillar, enquanto anormalmente fosforilada tau acumula como oligômeros e tangles neurofibrillary1,2. Estes agregados de proteína causam morte neuronal levando a perda de memória e declínio cognitivo progressivo subsequente. Outros fatores, incluindo não-produtivos neuroinflammation e uma redução da capacidade para limpar misfolded proteínas, podem exacerbar e acelerar a doença. Atualmente, as estratégias de intervenção contra AD fornecem alívio sintomático em grande parte, mas não há doença cura ou prevenção.
Aumentando a evidência sugere um papel-chave dos agregados de hyperphosphorylated tau na patologia do anúncio. Em seu estado não-patológica, tau é uma proteína nativamente desdobrada que vincula a microtúbulos e promove seu assembly para o citoesqueleto neuronal. Quando tau torna-se hyperphosphorylated, que separa o citoesqueleto e aglomerados em agregados de tau no neurônio, que são acreditados para causar a maioria da patologia associada com AD3. Agregados tau começa a acumular primeiro intracelular, mas como a doença progride, supõe-se para ser liberado de neurônios afetados para o espaço extracelular, do qual ele pode ser tomado até pelos neurônios saudáveis adjacentes ou synaptically conectados em um ” príon-como forma”. Uma vez internalizada, a agregação de tau induz mais tau agregação através de mudança conformacional modelo4.
De acordo com esta hipótese, terapias capazes de interromper a semeadura de tau podem retardar ou reverter o curso da doença neurodegenerativa mediada por tau. Para apoiar isso, ratos suscetíveis a Taupatia por mutação genética e passivamente injetado com anticorpos anti-tau mostram reduzida tau patologia e melhoria da função cognitiva5,6,7,8 ,9. No entanto, os mecanismos pelos quais os anticorpos terapêuticos reduzem patologia permanecem indescritíveis.
Um dos mecanismos propostos é mediada por anticorpos de captação e afastamento de patológicos formas agregadas de tau pela micróglia, células do sistema imunológico residente do cérebro. Publicações recentes sugerem que microglia pode eficientemente internalizar e degradar espécies patológicas tau e esta capacidade é reforçada por anticorpos anti-tau através um Fc-dependente mecanismo envolvendo receptores Fc expressados na superfície de microglia e receptor mediada por fagocitose10,11. Estes dados identificam microglia como potencialmente importantes efetores de anticorpos terapêuticos.
Descrevemos aqui um ensaio baseado em pilha para avaliar quantitativamente a absorção de tau por microglia. Dados gerados com este ensaio podem ajudar a elucidar os mecanismos de ação dos anticorpos anti-tau, representando assim uma ferramenta útil para avançar os anticorpos anti-tau para novas etapas de seu desenvolvimento como potencial tratamento AD.
Micróglia, células imunes do cérebro residente, foram recentemente identificados como importantes players em abordagens terapêuticas mediada por anticorpos para Tauopatias10,11. Apuramento de tau mediada por anticorpos por microglia, juntamente com o bloqueio da captação neuronal9, inibição ou desestabilização da fibrila formação13,14 e apuramento das fibrilas intraneuronal através de depósito lisossômico via15, tudo pode contribuir para a eficácia do anticorpo anti-tau observada no modelo do rato do Taupatia5,6,7,8,9.
Descrevemos aqui um ensaio baseado em pilha para avaliar quantitativamente a absorção de tau por microglia com o objectivo de criar uma ferramenta experimental para melhor caracterizar os mecanismos de ação dos anticorpos anti-tau.
Neste ensaio, adaptado de Funk et al 11, utiliza células BV-2, que são as células microglial murino imortalizado. Enquanto eles totalmente não podem ser comparados às pilhas microglial primária, eles apresentam muitas das características da microglia primário, incluindo a capacidade de robustamente fagocitam tanto Aβ e tau fibrilas11,16,17 ,18,19. Além disso, eles mostraram um comportamento reprodutível em vitro que as tornava altamente adequado para desenvolvimento de ensaio e estudos quantitativos, que requerem mínima variabilidade experimental. Além disso, linhas celulares imortalizado permitem maior rendimento de ensaio e eliminam a necessidade de sacrifício de animais em comparação com o uso de primário microglia.
Os agregados de tau que usamos neste ensaio foram obtidos utilizando o procedimento agregação altamente reprodutível em vitro que descrevemos recentemente13e mostrar a morfologia semelhante ao emparelhado filamentos helicoidais (resfrie) isolados do cérebro de AD pacientes. Enquanto nós não observaram qualquer resultado inesperado que pode ter sido causado por tau agregados da aderência às superfícies de plástico ou vidro, o uso de agregados de tau estável e bem caracterizadas desempenhou um papel crucial na reprodutibilidade neste ensaio.
Outro aspecto que contribuiu significativamente para ensaio de reprodutibilidade foi densidade celular. Os números de células por bem descrito no protocolo representam a densidade celular ideal nas condições descritas.
Diferentemente do que o Funk et al 11 descritos, que rotulado agregados tau com um corante sensível pH que aumenta significativamente sua fluorescência após internalização em organelas ácidas, assim permitindo a quantificação intracelular. Isto, juntamente com a digestão do trypsin de superfície limite imunocomplexos e/ou tau, garantias aquele sinal de fluorescência medida por citometria de fluxo é o resultado da absorção de tau, ao invés de vinculação à superfície celular. Além disso, o uso de um facilita de corante sensível pH deteção dos agregados de tau interiorizado em experimentos de microscopia sem a necessidade de digerir a superfície limite agregados de imunocomplexos/tau que teria então requer célula re-chapeamento e recuperação.
Nós também ainda mais otimizado a leitura de microscopia de nosso ensaio, em comparação com o que já havia sido descrito11, usando um corante altamente seletivo para organelas ácidas em nossos experimentos de microscopia que nos permitiram não só para confirmar anticorpo mediada captação de Tau, mas também a localização dos agregados de tau no compartimento endolysosomal.
O ensaio que desenvolvemos, tem especificidade ideal que resulta em uma boa janela experimental, permitindo uma separação forte entre amostras positivas e negativas. Curiosamente, o ensaio indiretamente detecta diferenças em afinidade de anticorpo, representando assim uma poderosa ferramenta para estudar as funções efetoras do anticorpo anti-tau.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer sua valiosa assistência técnica Alberto Carpinteiro Soares.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |