Nous décrivons ici une analyse axée sur la cellule pour évaluer quantitativement l’absorption tau par la microglie dans le but de créer un outil expérimental pour mieux caractériser les mécanismes d’action des anticorps anti-tau.
La maladie d’Alzheimer (ma) est une affection neurodégénérative progressive dans laquelle agrégées tau et accumulent des protéines amyloïdes dans le cerveau, provoquant un dysfonctionnement neuronal qui mène finalement au déclin cognitif. Agrégats de tau hyperphosphorylée dans le neurone sont censés causer la plus grande partie de la pathologie associée à AD. Ces agrégats sont censés être libérés dans le compartiment extracellulaire et repris par les neurones sains adjacents où ils induisent également l’agrégation tau. Cette diffusion « prion-like » peut être interrompu par anticorps lier et « neutraliser » les agrégats extracellulaires tau tel qu’illustré dans les modèles précliniques de souris de AD. Un des mécanismes proposés par lequel des anticorps thérapeutiques réduisent la pathologie est médiée par les anticorps de capture et le dédouanement des pathologiques formes agrégées de tau de la microglie. Nous décrivons ici un test quantitatif sur les cellules afin d’évaluer l’absorption tau de la microglie. Ce test utilise la lignée de cellules microgliales souris BV-2, permet une spécificité élevée, faible variabilité et un débit moyen. Données générées avec ce dosage peuvent contribuer à une meilleure caractérisation des fonctions effectrices anticorps anti-tau.
La maladie d’Alzheimer (ma) est une affection neurodégénérative progressive caractérisée par le changement de conformation et d’auto-assemblage de protéine β-amyloïde de peptide et tau en agrégats de pathologiques. Le peptide β-amyloïde soluble normal est converti en oligomère et fibrillaire β-amyloïde, tandis que la protéine tau anormalement phosphorylée accumule en oligomères et enchevêtrements neurofibrillaires1,2. Ces agrégats de protéines causent la mort neuronale conduisant à la perte de mémoire et de déclin cognitif progressif subséquent. Autres facteurs, y compris la neuroinflammation non productives et une diminution de la capacité d’effacer les protéines mal repliées, peuvent aggraver et accélérer la maladie. Actuellement, les stratégies d’intervention contre les AD apporter un soulagement symptomatique en grande partie, mais il n’y a aucun remède modificateurs de la maladie ou la prévention.
Plus en plus évident suggère un rôle clé des agrégats tau hyperphosphorylée dans la pathologie de la ma. Dans son état non pathologique, la protéine tau est une nativement dévoilée de protéine qui se lie aux microtubules et favorise leur assemblage dans le cytosquelette neuronal. Lorsque tau hyperphosphorylée, il se détache du cytosquelette et des grappes dans les agrégats de tau dans les neurones, qui sont censés causer la plus grande partie de la pathologie associée AD3. Agrégées tau commence à s’accumuler tout d’abord dans les cellules, mais que la maladie progresse, il est supposé d’être libéré de neurones touchés dans l’espace extracellulaire, d’où il peut être repris par neurones sains adjacents ou synapses connectées dans un » prion-comme manière ». Une fois intériorisée, l’agrégat de tau induit encore tau agrégation via changement conformationnel basé sur un modèle4.
Selon cette hypothèse, thérapies capables d’interrompre le tau semis pourraient ralentir ou inverser le cours de la maladie neurodégénérative induite par le tau. À l’appui de cela, souris susceptibles d’être tauopathy par mutation génétique et passivement injecté avec des anticorps anti-tau Voir la pathologie tau réduit et amélioration de la fonction cognitive5,6,7,8 ,,9. Toutefois, les mécanismes par lesquels des anticorps thérapeutiques réduisent la pathologie restent toujours insaisissables.
Un des mécanismes proposés est médiée par les anticorps de capture et le dédouanement des pathologiques formes agrégées de tau de cellules microgliales, cellules immunitaires résident du cerveau. Publications récentes suggèrent que la microglie peut efficacement internaliser et dégrader les espèces tau pathologiques et cette capacité est renforcée par les anticorps anti-tau via une Fc-dépendante mécanisme impliquant des récepteurs Fc exprimées à la surface de récepteurs et les cellules microgliales médiée par phagocytose10,11. Ces données identifient microglia comme effecteurs potentiellement importants d’anticorps thérapeutiques.
Nous décrivons ici un test cell pour évaluer quantitativement l’absorption tau de la microglie. Données générées avec ce dosage peuvent aider à élucider les mécanismes d’action des anticorps anti-tau, ce qui représente un outil utile pour faire progresser les anticorps anti-tau aux autres étapes de leur développement comme traitement potentiel de AD.
Cellules microgliales, cellules immunitaires du cerveau résident, ont été récemment identifiés comme des acteurs importants humorale des approches thérapeutiques pour tauopathies10,11. Clairance de tau humoral de microglie, avec blocage de capture neuronale9, l’inhibition ou la déstabilisation de la fibrille formation13,14 et le dédouanement des fibrilles intraneuronal via la lysosomal parcours15, tous pourraient contribuer à l’efficacité de l’anticorps anti-tau observée chez le modèle murin de tauopathy5,6,7,8,9.
Nous avons décrit ici un test cell pour évaluer quantitativement l’absorption tau par la microglie dans le but de créer un outil expérimental pour mieux caractériser les mécanismes d’action des anticorps anti-tau.
Ce test, adapté du Funk et al. 11, utilise des cellules de BV-2, qui sont les cellules microgliales murine immortalisées. Alors qu’ils ne peuvent pas complètement être comparés aux cellules microgliales primaire, elles disposent de bon nombre des caractéristiques des microglies primaire, y compris la capacité de manière robuste phagocytent Aβ et tau fibrilles11,16,17 ,18,19. En outre, ils ont montré un comportement reproductible in vitro qui les rend très approprié pour le développement de l’analyse et les études quantitatives, qui nécessitent la variabilité expérimentale minimale. À côté de cela, les lignées cellulaires immortalisées permettent des débits plus élevés de dosage et éliminent la nécessité de sacrifices d’animaux par rapport à l’usage des microglies primaire.
Les agrégats de tau, que nous avons utilisé dans cet essai ont été obtenues à l’aide de la procédure agrégation hautement reproductible in vitro que nous avons décrite récemment13et voir la morphologie similaire à jumelé filaments hélicoïdaux (FHJ) isolées du cerveau des AD patients. Alors que nous n’avons pas observé aucun résultat inattendu qui pourrait avoir été causé par tau agrégats adhérence aux surfaces de plastique ou de verre, l’utilisation d’agrégats stables et bien caractérisé tau a joué un rôle crucial dans la reproductibilité de ce test.
Un autre aspect qui a contribué de manière significative à la reproductibilité de dosage est la densité cellulaire. Le nombre de cellules par puits décrits dans le protocole représente la densité cellulaire optimale dans les conditions décrites.
Contrairement à ce que Funk et al. 11 décrit, nous tau agrégats marqués avec un colorant sensible de pH, ce qui augmente considérablement sa fluorescence après internalisation dans les organites acides, ce qui permet la quantification intracellulaire. Ceci, ainsi que la digestion trypsique de surface liées immunocomplexes et/ou tau, garanties ce signal de fluorescence mesurée par cytométrie en flux est le résultat de l’absorption de tau plutôt que la liaison à la surface cellulaire. En outre, l’utilisation d’une facilite de colorant photosensible pH détection d’agrégats de tau intériorisée dans des expériences de microscopie sans avoir besoin de digérer la surface bondissent agrégats immunocomplexes/tau qui seraient ensuite nécessite cellule modification des plaques et récupération.
Nous avons aussi encore optimisé l’affichage de microscopie de notre essai, par rapport à ce qui a été précédemment décrit11, en utilisant un colorant très sélectif pour les organites acides dans nos expériences de microscopie qui nous a permis non seulement de confirmer humoral absorption de Tau, mais aussi la localisation des agrégats de tau dans le compartiment d’endolysosomal.
Le test, nous avons développé, a une spécificité optimale qui se traduit par une bonne fenêtre expérimentale permettant une séparation forte entre les échantillons positifs et négatifs. Fait intéressant, le test détecte indirectement les différences affinité anticorps, ce qui représente un outil puissant pour étudier les fonctions effectrices anticorps anti-tau.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Alberto Carpinteiro Soares pour son aide technique.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |