Her beskriver vi en cellebasert analysen for å vurdere kvantitativt tau opptak av microglia med sikte på å skape en eksperimentell verktøy å bedre karakterisere virkningsmekanismer av anti-tau antistoffer.
Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv nevrodegenerative tilstand som samlet tau og amyloid proteiner akkumuleres i hjernen forårsaker neuronal dysfunksjon som til slutt fører til kognitiv svikt. Hyperphosphorylated tau mengdefunksjoner i Nevron antas å føre til de fleste av patologi forbundet med Annonsen. Disse aggregater er antok å bli utgitt i det ekstracellulære rommet og tatt opp av tilstøtende sunn neurons der de induserer ytterligere tau aggregering. Denne “prion-like” spre kan bli avbrutt av antistoffer bindende og «nøytralisere» ekstracellulære tau aggregater som vist i preklinisk musen modeller av Annonsen. En av de foreslåtte mekanismene som terapeutiske antistoffer redusere patologi er antistoff-mediert opptak og klarering av patologisk aggregert tau av microglia. Her beskriver vi en kvantitativ cellebasert analysen for å vurdere tau opptak av microglia. Denne analysen bruker musen microglial celle linje BV-2, gir høy spesifisitet, lav variasjon og medium gjennomstrømming. Data generert med denne analysen kan bidra til bedre karakteristikk av anti-tau antistoff funksjoner effektor.
Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv nevrodegenerative tilstand preget av conformational endringen og selvstendig montering av amyloid β peptid og tau protein i patologisk aggregat. Normal løselig amyloid β peptid omdannes til oligomeric og fibrillar amyloid β, mens unormalt fosforylert tau akkumuleres som oligomers og neurofibrillary ledninger1,2. Disse protein aggregater føre til nevronale døden til hukommelsestap og etterfølgende progressive kognitiv svikt. Andre faktorer, inkludert ikke-produktive neuroinflammation og redusert evne til å fjerne misfolded proteiner, kan forverre og akselerere sykdom. Foreløpig intervensjon strategier mot annonse gir i hovedsak symptomatisk lettelse, men det er ingen sykdom-modifisere kur eller forebygging.
Økende bevis antyder en nøkkelrolle i hyperphosphorylated tau mengdefunksjoner i patologi av Annonsen. I ikke-patologisk tilstand er tau en innfødt ufalsede protein som binder seg til piskehale som henger og fremmer deres forsamlingen neuronal cytoskeleton. Når tau blir hyperphosphorylated, det løsner fra cytoskeleton og klynger i tau mengdefunksjoner i Nevron, som forårsaker de fleste av patologi forbundet med Annonsen3. Samlet tau starter samler først intracellulært, men som sykdommen utvikler seg, det antas å bli befridd fra berørte nerveceller i ekstracellulære plass, som det kan bli tatt opp av tilstøtende eller synaptically tilkoblet sunn nerveceller i en ” Prion-lignende måte”. En gang internalisert, induserer tau samlet ytterligere tau aggregering via mal conformational endre4.
Ifølge denne hypotesen, kan terapi kan avbryte tau seeding bremse eller reversere løpet av tau-mediert nevrodegenerative sykdommer. Dette viser mus laget utsatt for tauopathy av genetisk mutasjon og passivt injisert med anti-tau antistoffer redusert tau patologi og bedre kognitiv funksjon5,6,7,8 ,9. Men fortsatt mekanismer som terapeutiske antistoffer redusere patologi unnvikende.
En av de foreslåtte mekanismene er antistoff-mediert opptak og klarering av patologisk aggregert tau av microglia, hjernens bosatt immunceller. Siste publikasjoner foreslår at microglia kan effektivt internalisere og svekke patologisk tau arter og dette forsterkes av anti-tau antistoffer via en Fc-avhengig mekanisme som involverer Fc reseptorer uttrykt på overflaten av Microglia og reseptor mediert fagocytose10,11. Disse dataene identifiserer microglia som potensielt viktig effektor av terapeutiske antistoffer.
Her beskriver vi en cellebasert analysen for å vurdere kvantitativt tau opptak av microglia. Data generert med denne analysen kan hjelpe Klargjørende virkningsmekanismer av anti-tau antistoffer dermed representerer en nyttig verktøyet å avansere anti-tau antistoffer til ytterligere skritt av deres utvikling som potensielle AD behandling.
Microglia, bosatt hjernens immunceller, har nylig identifisert som viktige spillere i antistoff-mediert terapeutiske metoder for tauopathies10,11. Antistoff-mediert tau godkjennes av microglia, sammen med blokkering av neuronal opptak9, hemming eller destabilisering av fibril formasjon13,14 og rydding av intraneuronal fibrils via den lysosomale Pathway15, kan alle bidra til anti-tau antistoff effekten i musemodell av tauopathy,5,,6,,7,,8,,9.
Vi beskrevet her en cellebasert analysen for å vurdere kvantitativt tau opptak av microglia med sikte på å skape en eksperimentell verktøy å bedre karakterisere virkningsmekanismer av anti-tau antistoffer.
Denne analysen, tilpasset fra Funk et al. 11, bruker BV-2 celler, som er udødeliggjort murine microglial celler. Mens de ikke fullt sammenlignes primære microglial celler, de har mange av egenskapene til primære microglia, inkludert muligheten for robust phagocytose både Aβ og tau fibrils11,16,17 ,18,19. Videre, de viste en reproduserbar atferd i vitro som gjorde dem velegnet for analysen utvikling og kvantitative studier som krever minimal eksperimentell variasjoner. Foruten dette, udødeliggjort cellelinjer tillate høyere analysen gjennomstrømming og eliminere behovet for dyr offer sammenlignet med bruk av primære microglia.
Tau aggregater vi brukte i denne analysen var får svært reproduserbar i vitro aggregering prosedyren at vi nylig beskrevet13, og Vis lignende morfologi til sammen spiralformede filamenter (PHFs) isolert fra hjernen annonse pasienter. Mens vi ikke observerer noen uventede resultater som kan ha blitt forårsaket av tau aggregater overholdelse av plast eller glass overflater, spilte bruk av stabile og godt preget tau aggregater en avgjørende rolle i reproduserbarhet av denne analysen.
Et annet aspekt som bidro til analysen reproduserbarhet var celle tetthet. Antall celler per brønn beskrevet i protokollen representerer optimal celle tettheten i beskrevet forhold.
Annerledes enn hva Funk et al. 11 beskrevet, vi merket tau aggregat med en pH følsom fargestoff som øker sin fluorescens på internalisering i surt organeller, dermed gir for intracellulær kvantifisering. Dette, sammen med trypsin fordøyelsen av overflaten bundet immunocomplexes og/eller tau, garanterer fluorescens signalet målt ved flowcytometri er et resultat av tau opptak i stedet for binding til mobilnettet overflaten. Videre krever bruk av en pH følsom fargestoff Letter oppdagelsen av internalisert tau aggregater mikroskopi eksperimenter uten behovet av fordøye overflaten bundet immunocomplexes/tau aggregater som ville deretter cellen re plating og gjenoppretting.
Vi har også optimalisert mikroskopi avlesing av våre analysen, sammenlignet med hva har tidligere blitt beskrevet11, ved hjelp av en svært selektiv farge for surt organeller våre mikroskopi eksperimenter som ikke tillot oss bare å bekrefte antistoff-mediert tau opptak, men også lokalisering av tau aggregater i endolysosomal rommet.
Analysen vi utviklet, har optimal spesifisitet som resulterer i god eksperimentelle vindu slik at en sterk separasjon mellom positive og negative prøvene. Interessant, oppdager analysen indirekte forskjeller i antistoff affinitet dermed representerer et kraftig verktøy for å studere anti-tau antistoff funksjoner effektor.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Alberto Carpinteiro Soares for hans verdifulle kundestøtte.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |