Burada nicelik eylem Anti-tau antikorların mekanizmaları daha iyi tanımlamak için bir araştırma aracı oluşturma amacıyla microglia tarafından tau alımını değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklayın.
Alzheimer hastalığı (Ah) bir ilerici nörodejeneratif durumda tau toplanan ve sonunda neden bilişsel gerileme için nöronal disfonksiyon neden beyin amiloid proteinler birikir var. Nöron hyperphosphorylated tau toplamları en çok reklam ile ilişkili patoloji neden inanılıyor. Bu toplamları ekstraselüler bölmesine yayımlanması için kabul ve nerede daha fazla tau toplama neden bitişik sağlıklı nöronlar tarafından alınan. Bu “deli dana gibi” yayılan antikorlar bağlama ve “reklam preklinik fare modellerinde gösterildiği gibi hücre dışı tau toplamları nötralize” özelliği tarafından durdurulabilir. Hangi tarafından patoloji terapötik antikorlar azaltmak önerilen mekanizmaları antikor aracılıklı alımı ve gümrükleme tau microglia tarafından patolojik toplanan formları biridir. Burada, tau alımı microglia tarafından değerlendirmek için nicel bir hücre tabanlı tahlil açıklayın. Bu tahlil fare mikroglial hücre kültürünü BV-2 kullanır, yüksek özgüllük, düşük değişkenliği ve orta üretilen iş sağlar. Bu tahlil ile oluşturulan veri Anti-tau antikor efektör fonksiyonları daha iyi bir karakterizasyonu için katkıda bulunabilir.
Alzheimer hastalığı (Ah) konformasyonal değişim ve kendinden montajlı amiloid Beta peptid ve tau protein patolojik toplamları ile karakterize bir ilerici nörodejeneratif durumdur. Anormal derecede fosforile tau reaksiyonlar ve neurofibrillary düğüm1,2biriken iken normal çözünür amiloid Beta peptid oligomeric ve fibriler amiloid β dönüştürülür. Bu protein toplamları hafıza kaybı ve sonraki ilerici bilişsel gerileme için önde gelen nöronal ölüme neden. Üretken olmayan neuroinflammation ve misfolded proteinler, temizlemek için azaltılmış bir yeteneği de dahil olmak üzere diğer faktörler, azdırmak ve hastalık hızlandırmak. Şu anda, müdahale stratejilerinin reklam karşı büyük ölçüde semptomatik rahatlama sağlar, ama hiçbir hastalığı değiştirme tedavisi veya önleme.
Kanıt artan önemli bir rol hyperphosphorylated tau toplamları içinde reklam patoloji göstermektedir. Patolojik olmayan haliyle tau mikrotübüller için bağlar ve nöronal sitoiskeleti onların derlemeye yerli gelişeceğini bir proteindir. Tau hyperphosphorylated olduğunda, sitoiskeleti ayırır ve içine hangi reklam3ile ilişkili patoloji çoğunu neden inanılıyor tau toplamları nöron kümeleri. İlk intracellularly biriken tau başlar toplanan, ancak hastalık ilerledikçe etkilenen neurons ekstrasellüler alana hangi o-ebilmek alınmak bitişik veya synaptically bağlı sağlıklı nöronlarda tarafından yayımlanması için kabul edilir bir ” deli dana benzeri şekilde”. İçselleştirilmiş bir kez tau toplamak daha fazla tau toplama yolu ile şablonu esas alan konformasyonal değişim4neden olmaktadır.
Bu varsayıma göre tedaviler tau tohum kesintiye uğratmasını yetenekli yavaşlatmak veya tau-aracılı nörodejeneratif hastalık seyri ters. Bu destek, azaltılmış tau patoloji ve geliştirilmiş bilişsel işlev5,6,7,8 genetik mutasyon tauopathy için duyarlı yapılır ve pasif Anti-tau antikorlar ile enjekte fareler gösterir ,9. Ancak, hangi tarafından patoloji terapötik antikorlar azaltmak mekanizmaları hala zor kalır.
Önerilen mekanizmaları antikor aracılıklı alımı ve gümrükleme tau microglia, beynin yerleşik bağışıklık hücreleri tarafından patolojik toplanan formları biridir. Son yayınlar microglia verimli bir şekilde içselleştirmesi ve patolojik tau türler bozulmasına yol açar ve bu yeteneği yüzeyinde ifade Fc reseptörü içeren anti-tau antikorlar ile Fc bağımlı mekanizma tarafından geliştirilmiş öneririm fagositoz10,11microglia ve reseptör aracılı. Bu veri microglia terapötik antikorlar potansiyel olarak önemli effectors tanımlayın.
Biz burada nicelik tau alımı microglia tarafından değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil tanımlamak. Bu tahlil ile oluşturulan veri eylem böylece Anti-tau antikorlar gelişimleri potansiyel reklam tedavi olarak daha fazla adımlardan geçmek için yararlı bir araç temsil eden Anti-tau antikorların mekanizmaları elucidating yardımcı olabilir.
Microglia, ikamet beynin bağışıklık hücreleri, son zamanlarda tespit edilmiştir antikor aracılıklı tedavi yaklaşımları tauopathies10,11önemli oyuncular olarak. Antikor aracılıklı tau izni tarafından microglia nöronal alımını9, inhibisyon veya istikrarsızlık fibril oluşumu13,14 ve intraneuronal liflerinde ile boşluk lizozomal engelleme ile birlikte, yol15, tüm tauopathy5,6,7,8,9fare modelde gözlenen Anti-tau antikor etkinliği katkı.
Biz burada kantitatif eylem Anti-tau antikorların mekanizmaları daha iyi tanımlamak için bir araştırma aracı oluşturma amacıyla microglia tarafından tau alımını değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil nitelendirdi.
Bu tahlil, Funk ve ark. adapte 11, ölümsüzleştirdi fare mikroglial hücreler BV-2 hücreleri kullanır. Birincil mikroglial hücrelere tam olarak karşılaştırılamaz iken, onlar birçok özelliği birincil microglia özelliklerini sağlam yeteneği dahil olmak üzere Aβ ve tau liflerinde11,16,17 phagocytose ,18,19. Ayrıca, onları tahlil geliştirme ve en az deneysel değişkenlik gerektiren nicel çalışmalar için son derece uygun yapılmış bir tekrarlanabilir davranış vitro gösterdiler. Bu, yanında ölümsüzleştirdi hücre satır tahlil akışı sağlayarak daha yüksek izin ve birincil microglia kullanımına göre hayvan kurban etmek için gereksinimini ortadan kaldırır.
Bu tahlil kullandığımız tau toplamları son zamanlarda13ve gösteri için benzer görünümdeki helisel filamentler (PHFs) reklam beyin izole eşleştirilmiş açıklanan son derece tekrarlanabilir vitro toplama yordamı kullanarak elde edilmiştir hastalar. Biz tau toplamları bağlılık plastik ya da cam yüzeyler tarafından neden olabilir herhangi bir beklenmedik sonuçlar gözlemlemek değil iken, istikrarlı ve iyi karakterize tau agrega kullanımı bu tahlil tekrarlanabilirlik içinde önemli bir rol oynadı.
Önemli ölçüde tekrarlanabilirlik tahlil katkıda başka bir yönü hücre yoğunluğu oldu. İyi iletişim kuralında tanımlanan başına hücre sayısı optimum hücre yoğunluğu açıklanan koşullarda temsil eder.
Farklı daha ne Funk vd. açıklanan 11 , biz böylece hücre içi miktar için izin tau toplamları, floresans içselleştirilmesi asidik organelleri, üzerine önemli ölçüde artıran bir pH hassas boya ile etiketlenmiş. Bu, immunocomplexes ve/veya tau tripsin sindirim yüzey ile birlikte bağlı, floresans sinyal akış sitometresi tarafından ölçülen garanti tau alımını tercihan–dan bağlama hücresel yüzeye sonucu. Ayrıca, hücre yeniden kaplama ve kurtarma içselleştirilmiş tau toplamları mikroskobu deneylerde yüzey sindirerek gerek kalmadan tespiti o zaman-cekti immunocomplexes/tau toplamları bağlı bir pH hassas boya hareket hızları kullanımını gerektirir.
Biz de daha ne daha önce açıklanan11için olmuştur göre bizim testin mikroskobu eşleştirmeyi optimize, bize izin verilmez bizim mikroskobu deneylerde asidik organelleri için çok seçici bir boya kullanarak onaylamak için tek antikor aracılı Tau alımı, aynı zamanda yerelleştirme tau toplamları endolysosomal yerde.
Geliştirdiğimiz, tahlil iyi bir deneysel penceresini olumlu ve olumsuz örnekleri arasında güçlü bir ayrım sonucunda en iyi özgüllük vardır. İlginçtir, tahlil böylece Anti-tau antikor efektör fonksiyonları eğitim için güçlü bir araç temsil eden antikor benzeşme farklılıkları dolaylı olarak algılar.
The authors have nothing to disclose.
Alberto Carpinteiro Soares onun değerli teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |