Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo
Summary
Locus coeruleus è un piccolo gruppo di neuroni coinvolti in una varietà di processi fisiologici. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di sezioni di cervello di topo per lo studio di proteine e metalli in questo nucleo.
Abstract
Locus coeruleus (LC) è un importante hub di norepinefrina producendo neuroni che modulano un numero di funzioni fisiologiche. Le anomalie strutturali o funzionali di LC parecchie regioni del cervello, compreso la corteccia, ippocampo e nel cervelletto di impatto e possono contribuire alla depressione, disturbo bipolare, ansia, così come la malattia di Parkinson e Alzheimer. Questi disturbi sono spesso associati con metallo disparità, ma il ruolo dei metalli in LC è solo parzialmente capito. Studi morfologici e funzionali di LC sono necessari per comprendere meglio le patologie umane e contributo dei metalli. I topi sono un modello sperimentale ampiamente usato, ma il mouse LC è piccolo (~0.3 mm di diametro) e difficile da individuare per un non-esperto. Qui, descriviamo un protocollo basato su immunohistochemistry passo-passo per localizzare la LC nel cervello del topo. Dopamina-β-idrossilasi (DBH) e in alternativa, tirosina idrossilasi (TH), entrambi gli enzimi altamente espressi in LC, sono usati come indicatori immunohistochemical nelle fette del cervello. Sezioni adiacenti alle sezioni contenenti LC possono essere utilizzati per ulteriori analisi, tra cui l’istologia per studi morfologici, test metabolici, così come formazione immagine di metallo da microscopia di fluorescenza di raggi x (XFM).
Introduction
Locus coeruleus (LC) è una regione importante nel tronco cerebrale e un importante sito di produzione di noradrenalina (NE)1. Il LC Invia proiezioni in tutto il cervello2 la corteccia, l’ippocampo e il cervelletto3 e regola i principali processi fisiologici, tra cui ritmo circadiano4,5, attenzione e memoria6, sforzo7, processi cognitivi8e commozione9,10. Disfunzione di LC è stata implicata in patologie neurologiche e neuropsichiatriche11, compreso Parkinson malattia12,13,14, Alzheimer malattia14, depressione15 ,16,17, disturbo bipolare18,19e l’ansia20,21,22,23, 24. tenuto conto di questi ruoli, analisi di LC sono fondamentale per studiare la sua funzione e disfunzione.
Topi sono ampiamente utilizzati per lo studio di processi fisiologici e patofisiologici. A causa del loro di piccola dimensione, il mouse LC ha un diametro medio di ~ 300 μm, che porta a difficoltà a individuare la struttura. Durante il sezionamento del cervello, la LC può facilmente essere perso in sezioni coronali o sagittale. Disponibili studi che descrivono identificazione di LC in animali non offrono un protocollo passo-passo che un non-esperti possono seguire1,25. Così, per offrire una guida per la localizzazione di LC, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per individuare questa regione nel cervello del topo per diverse applicazioni (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Il protocollo si applica attentamente controllato cervello rilevamento di sezionamento e immunohistochemical di DBH26,27, o in alternativa TH24, entrambi gli enzimi altamente arricchiti nell’ LC28. LC è individuato da immunohistochemistry, fettine di cervello adiacente possono essere utilizzati per ulteriori studi, compreso analisi morfologiche e metaboliche, come pure gli studi di formazione immagine del metallo tramite fluorescenza a raggi x microscopia (XFM)29. Descriviamo XFM come esempio in questo protocollo (Figura 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Corretto orientamento del campione è un passo cruciale in questo protocollo. Perché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per individuare LC (confine tra cervelletto e collicolo inferiore), è importante che le sezioni vengano allineati correttamente. Questo richiede cura nella corretta impostazione del cervello nella matrice affettatrice del cervello del mouse. Si consiglia di tagliare ~ 500 μm più tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo. L’errore…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Abigael Muchenditsi per la manutenzione della Colonia del mouse. Impiego della fonte del fotone avanzate all’Argonne National Laboratory è stata sostenuta da US Department of Energy, Office of Science, ufficio di energia scienze di base, sotto il numero di contratto: DE-AC02-06CH11357. Ringraziamo Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt per supporto utente e assistenza presso la fonte del fotone avanzate. Questo lavoro è stato finanziato dalla 2R01GM101502 di grant del National Institute of Health a SL.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
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