쥐의 뇌에서 로커 스 Coeruleus의 지역화
Summary
로커 스 coeruleus는 다양 한 생리 적 과정에에서 관여 하는 신경의 작은 클러스터. 여기, 우리는 단백질이이 핵에 금속의 연구에 대 한 마우스 뇌 섹션을 준비 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
로커 스 coeruleus (LC)는 다양 한 생리 기능을 조절 하는 신경 세포를 생산 하는 노르의 주요 허브 이다. LC의 구조적 또는 기능적 이상 피 질, 해 마와 소 뇌를 포함 하 여 여러 가지 뇌 영역에 영향을 하 고 우울증, 양극성 장애, 불안로 파 킨 슨 질환과 Alzheimer 질병에 기여할 수 있습니다. 이 질환은 종종 금속 misbalance와 관련 된 하지만 lc에서의 역할은 부분적 으로만 이해. LC의 형태 론 적과 기능 연구는 더 나은 인간의 병 리와 금속의 기부를 이해 필요 합니다. 마우스는 널리 사용 되는 실험적인 모델 이지만 마우스 LC 작은 (~0.3 m m 직경)와 비-전문가 대 한 식별 하기 어렵다. 여기, 우리는 쥐의 뇌에 LC를 지역화 하는 단계별 immunohistochemistry 기반 프로토콜을 설명 합니다. 도파민-β-hydroxylase (DBH), 및 양자 택일로, 티로신 hydroxylase (TH), 액정, 높은 표현 두 효소 뇌 조각에서 immunohistochemical 표식으로 사용 됩니다. LC 포함 된 섹션에 인접 한 섹션 x 선 형광 현미경 검사 법 (XFM) 하 여 형태학 연구, 신진 대사 테스트로 금속 영상 조직학을 포함 하 여 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
로커 스 coeruleus (LC) brainstem에 노르 (NE) 생산1의 주요 사이트는 중요 한 지역 이다. LC 피 질, 해 마와 소 뇌3 뇌2 에 걸쳐 예측을 전송 하 고 circadian 리듬4,5, 주 및 메모리6를 포함 하 여 주요 생리 적 프로세스 조절 7,8, 인지 과정 및 감정9,10스트레스. LC의 부전 신경 정신병 무질서11, 파 킨 슨 병12,13,14, Alzheimer 질병14, 우울증15 포함 하 여 연루 되어 ,,1617, 양극성 질환18,19및 불안20,,2122,23, 24. 이러한 역할을 감안할 때, LC의 분석은 그것의 기능과 역 기능을 공부 하 고 중요 한.
생쥐는 생리 및 pathophysiologic 프로세스의 연구에 널리 사용 됩니다. 그들의 작은 크기로 인해 마우스 액정 구조를 찾는데 어려움을 선도 하는 ~ 300 μ m의 평균 직경이 있다. 뇌 단면, 동안 LC 코로나 또는 화살 섹션에서 쉽게 놓칠 수 수 있습니다. 사용할 수 연구 동물에서 LC의 식별을 설명 하는 단계별 프로토콜을 제공 하지 않습니다 비-전문가1,25를 따를 수 있습니다. 따라서, LC의 지역화에 대 한 지침을 제공, 우리는 몇 가지 애플 리 케이 션 (그림 1, , 그림 2 그림 3)에 대 한 쥐의 뇌에서이 영역을 찾으려고 개발 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 DBH26,27, 또는 양자 택일로 회24, 신중 하 게 제어 뇌 단면 및 immunohistochemical 검출을 두 효소 LC28에서 높게 풍성 하 게 적용 됩니다. LC는 immunohistochemistry 여 일단, 인접 한 뇌 조각 추가 연구, 형태학 및 대사 분석 뿐만 아니라 x-선 형광 현미경 검사 법 (XFM)29통해 금속 이미징 연구를 포함 하 여 사용할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜 (그림 3)에서 예를 들어 XFM를 설명합니다.
Protocol
동물의 연구는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 (ACUC) 프로토콜 번호 M017M385에 의해 승인 되었다. 1. 두뇌 슬라이스 고정, 3 %isoflurane의 응용 프로그램에서 마우스를 anesthetize. 15 mL microcentrifuge 튜브에와 isoflurane 방울과 면봉을 담근 다. 튜브에 동물의 코를 놓고는 isoflurane 흡입을 합니다. 발가락-핀치에 응답의 부족에 의해 마 취의 깊이를 확인 합니다. </…
Representative Results
변경 (예: Cu, Fe, Zn, 그리고 미네소타) 금속 항상성에서 LC34,35에 변화를 포함 한 신경학 적 장애에서 자주 관찰 된다. 따라서, 뇌의 금속 수준 결정은 질병 메커니즘의 이해를 위해 필요 합니다. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 뇌 섹션 잘라내기 및 LC에서 다른 금속 수준의 계량 LC 외부 지역에서 수준에 그들을 비교 하 사…
Discussion
제대로 방향을 표본이이 프로토콜의 중요 한 단계입니다. 우리를 사용 하는 뇌의 등 쪽 표면에의 해 부 기능 LC (소 뇌와 열 등 한 colliculus 사이 경계)를 찾을 수 있기 때문에 섹션 제대로 정렬 될 중요 하다. 이 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스로 뇌를 제대로 설정에 주의 해야 합니다. 앞쪽 및 후부 LC 핵 누락을 피하기 위해 더 많은 조직 ~ 500 μ m을 절단 하는 것이 좋습니다. 가장 일반적인 실수는 LC를 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 마우스 식민지의 유지 보수에 대 한 Abigael Muchenditsi 감사합니다. 아르곤 국립 연구소에서 고급 광자 소스를 사용 하 여 미국 에너지 부, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학, 계약 번호 아래에 의해 지원 되었다: 드-AC02-06CH11357. 우리 감사 올가 Antipova와 박사 스테판 Vogt 사용자 지원 및 고급 광자 소스에서 지원. 이 작품은 SL에 건강의 국가 학회 교부 금 2R01GM101502에 의해 투자 되었다.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
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Citer Cet Article
Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).