الميكانيكية ميكرونيزيشن من ليبواسبيراتيس للعلاج بالتجدد
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على كسر الأوعية الدموية stromal من الأنسجة الدهنية من خلال سلسلة من العمليات الميكانيكية، والتي تشمل استحلاب وسينتريفوجيشنز متعددة.
Abstract
كسر الأوعية الدموية stromal (SVF) أصبحت أداة التجدد للأمراض المختلفة؛ ومع ذلك، تنظم التشريعات صرامة التطبيق السريري لمنتجات الخلية باستخدام كولاجيناز. نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنشاء أن خليط حقن الخلايا صندوق التبرعات الخاص والمصفوفة خارج الخلية الأصلية من الأنسجة الدهنية بعملية ميكانيكية بحتة. ليبواسبيراتيس موضع الطرد مركزي ونسج في س 1,200 ز لمدة 3 دقائق. الطبقة الوسطى التي جمعت وفصلها إلى طبقتين (الدهون عالية الكثافة في الجزء السفلي) والدهون منخفضة الكثافة في الجزء العلوي. هو مستحلب الطبقة العليا مباشرة بتحويل إينتيرسيرينجي، بمعدل 20 مل/s ل x 6 إلى 8 x. يتم فصل الدهون مستحلب في 2,000 س ز لمدة 3 دقائق، والمادة لزجة تحت طبقة النفط التي يتم جمعها ويعرف بأنه المصفوفة خارج الخلية (ECM)/صندوق التبرعات الخاص-جيل. يتم تجميع النفط في الطبقة العليا. إضافة إلى 15 مل الدهون عالية الكثافة حوالي 5 مل من زيت ومستحلب بتحويل إينتيرسيرينجي، بمعدل 20 مل/s ل x 6 إلى 8 x. يتم فصل الدهون مستحلب في 2,000 س ز لمدة 3 دقائق، وأيضا المادة لزجة ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل. بعد زرع الأعضاء من ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل في الفئران عارية، تحصد الاختلاس وتقييمها بدراسة نسيجية. وتبين النتيجة أن هذا المنتج لديه القدرة على التجدد في الأنسجة الدهنية العادية. هذا الإجراء إجراء الانفصال ميكانيكية بسيطة وفعالة لاختصار الخلايا صندوق التبرعات الخاص جزءا لا يتجزأ من بهم ECM داعمة الطبيعية لأغراض التجدد.
Introduction
تقدم علاجات الخلايا الجذعية تحولاً نموذجياً لإصلاح الأنسجة وتجديدها حتى أنها قد توفر نظام علاجية بديلة لمختلف الأمراض1. الخلايا الجذعية (مثلاً، المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية الجنينية) إمكانيات علاجية كبيرة ولكن محدودة بسبب تنظيم الخلية والاعتبارات الأخلاقية. المستمدة من الدهنية الوسيطة stromal/الخلايا الجذعية (الخزفية) من السهل الحصول على من ليبواسبيراتيس ولا تخضع لنفس القيود؛ وهكذا، فقد أصبح على نوع خلية مثالية للطب التجديدي العملية2. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي نونيمونوجينيك، ولديها موارد وفيرة من الدهون الذاتي3.
حاليا، يتم الحصول على الخزفية أساسا بوساطة كولاجيناز الهضم من الأنسجة الدهنية. ويتضمن الكسر الأوعية الدموية stromal (SVF) من الأنسجة الدهنية الخزفية والسلف غشائي الخلايا وبيريسيتيس والخلايا المناعية. على الرغم من أن الحصول على كثافة عالية من صندوق التبرعات الخاص/الخزفية انزيماتيكالي تبين أن تكون لها آثار مفيدة، ينظم التشريع في عدة بلدان دقة التطبيق السريري للمنتجات المستندة إلى الخلية باستخدام كولاجيناز4. هضم الأنسجة الدهنية مع كولاجيناز لمدة 30 دقيقة إلى ح 1 للحصول على خلايا صندوق التبرعات الخاص يزيد من خطر كل المواد الخارجية في إعداد والتلوث البيولوجي. ثقافة ملتصقة وتنقية الخزفية، التي تستغرق أيام لأسابيع، تتطلب معدات مختبرية محددة. وعلاوة على ذلك، وفي معظم الدراسات، تستخدم الخلايا صندوق التبرعات الخاص والخزفية في تعليق. دون الحماية من المصفوفة خارج الخلية (ECM) أو ناقل آخر، معرضة بالخلايا الحرة ويسبب احتفاظ بخلية فقراء بعد الحقن، وخرق النتيجة العلاجية5. كل هذه الأسباب الحد من تطبيق مزيد من العلاج بالخلايا الجذعية.
للحصول على الخزفية من الأنسجة الدهنية دون وساطة كولاجيناز الهضم، كانت عدة إجراءات التجهيز الميكانيكية، بما في ذلك الطرد المركزي، الميكانيكية تقطيع وتمزيق ونتائج وتنميق، نمواً6،7 , 8 , 9-ويعتقد أن هذه الطرق لاختصار الخزفية والأنسجة بتعطيل ميكانيكيا adipocytes ناضجة وهذه الحويصلات الحاوية للنفط. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الاستعدادات، التي تحتوي على تركيزات عالية من الخزفية، إمكانات علاجية كبيرة كنماذج الطب التجديدي في الحيوان8،،من910.
في عام 2013، قدم تونارد et al. نانوفات تطعيم التقنية، الذي ينطوي على إنتاج مستحلب ليبواسبيراتيس بتجهيز11إينتيرسيرينجي. يمكن كسر قوة القص تم إنشاؤها بواسطة إينتيرسيرينجي تحول بشكل انتقائي adipocytes ناضجة. استناداً إلى النتائج التي تتوصل إليها، قمنا بتطوير أسلوب معالجة ميكانيكية بحتة أن يزيل معظم الدهون والسوائل في ليبواسبيراتيس، ترك ECM هورمونات، وهو ECM/صندوق التبرعات الخاص-جيل12وخلايا التبرعات فقط. هنا، نحن تصف تفاصيل عملية ميكانيكية للأنسجة الدهنية المستمدة من الإنسان لإنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-الهلام.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأظهرت القائمة على الخلايا الجذعية العلاج التجديدي فائدة محتملة كبيرة في أمراض مختلفة. الخزفية هي المرشحين العلاجية المعلقة لأنها سهلة للحصول على ولديهم القدرة على إصلاح الأنسجة وتجديد الأنسجة رواية15. ومع ذلك، هناك قيود على توسيع نطاق التطبيق السريري وأنها تتطلب إجراءات مع…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده عمل هذه المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعة من الصين (81471881, 81601702, 81671931)، ومؤسسة العلوم الطبيعية مقاطعة قوانغدونغ الصينية (2014A030310155)، و “مؤسسة مسؤول من مستشفى نانفانغ” (2014B009، 2015Z002، 2016Z010، 2016B001).
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
- Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
- Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
- van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
- Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
- Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
- Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product – stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
- Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
- Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
- Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
- Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
- Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
- Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
- Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).
