Механический микронизации Lipoaspirates для восстановительной терапии
Summary
Здесь мы представляем протокол для получения стромальные сосудистой дроби от жировой ткани через ряд механических процессов, которые включают эмульгирования и несколько centrifugations.
Abstract
Стромальные сосудистой дроби (СФДВ) стал регенеративной инструментом для различных заболеваний; Однако законодательство строго регулирует клинического применения клеточных продуктов с помощью коллагеназы. Здесь мы представляем протокол для создания инъекционные смеси СФДВ клеток и родной внеклеточная матрица из жировой ткани, чисто механического процесса. Lipoaspirates поместить в центрифуге и вращаться на 1200 x g на 3 мин. Средний слой собираются и разделены на два слоя (плотностью внизу) и низкой плотностью жиров на вершине. Верхний слой непосредственно эмульгированных переключив intersyringe, со скоростью 20 мл/сек для 6 x до 8 x. Эмульгированные жиры центрифугируют в 2000 x g на 3 мин, липкое вещество под слоем нефти является сбор и определяется как внеклеточного матрикса (ECM) / SVF-гель. Масло в верхнем слое собирается. Примерно в 5 мл масла добавляется 15 мл высокой плотности жира и эмульгированных переключив intersyringe, со скоростью 20 мл/сек для 6 x до 8 x. Эмульгированные жиры центрифугируют в 2000 x g на 3 мин, и липкое вещество также ECM/SVF-гель. После пересадки ECM/SVF-гель в обнаженной мышей трансплантат собирают и оценены гистологическое обследование. Результат показывает, что этот продукт имеет потенциал, чтобы восстановить в нормальных жировой ткани. Эта процедура не является процедурой простые, эффективные механические диссоциации уплотнить клетки СФДВ, встроенный в их естественной поддержки ECM для восстановительных целей.
Introduction
Стволовых клеток лечение обеспечивают парадигмы для восстановления тканей и регенерации, так что они могут предложить альтернативные терапевтический режим для различных заболеваний1. Стволовые клетки (например, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и эмбриональных стволовых клеток) имеют большой лечебный потенциал, но ограничены из-за регулирования клеток и этических соображений. Жировой производные мезенхимальных стромальных/стволовые клетки (ИСС) легко получить от lipoaspirates и не подлежат тем же ограничениям; Таким образом он стал тип ячейки для практической восстановительной медицины2. Кроме того они nonimmunogenic и обильные ресурсы из аутологичной жира3.
В настоящее время ИСС получаются главным образом коллагеназы опосредованной пищеварение жировой ткани. Стромальные сосудистой часть жировой ткани (СФДВ) содержит ИСС, клетки эндотелия прародителю, pericytes и иммунных клеток. Хотя получение высокой плотности СФДВ/ИСС ферментативно было показано иметь благотворное воздействие, в нескольких странах законодательство строго регулирует клиническое применение продуктов на основе клеток с помощью коллагеназы4. Переваривания жировой ткани с коллагеназы за 30 мин до 1 ч для получения СФДВ клеток увеличивает риск как экзогенные материал в подготовке и биологического загрязнения. Адгезивная культуры и очистки ИСС, который принимает дней недели, требуют конкретного лабораторного оборудования. Кроме того в большинстве исследований, используются СФДВ клетки и ИСС в суспензии. Без защиты внеклеточного матрикса (ECM) или другой перевозчик свободные ячейки являются уязвимыми, вызвать задержку бедных клеток после инъекции и компромисс лечебный результат5. Все эти причины ограничить дальнейшее применение стволовых клеток.
Чтобы получить ИСС из жировой ткани без коллагеназы опосредованной пищеварение, несколько процедур механической обработки, включая центрифугирования, механического измельчения, дробления, пюре и измельчения, были развитые6,7 , 8 , 9. Предполагается, что эти методы уплотняют ткани и ИСС, механически нарушая Зрелые адипоциты и их везикул, содержащих нефть. Кроме того эти препараты, содержащие высокие концентрации ИСС, показал значительный терапевтический потенциал как регенеративной медицины в животных моделей8,9,10.
В 2013 году Tonnard et al. представил nanofat, прививки техника, которая включает в себя производство эмульгированные lipoaspirates, intersyringe, обработки11. Усилие сдвига, созданный intersyringe ветра может выборочно перерыв Зрелые адипоцитов. Основываясь на своих выводах, мы разработали метод чисто механической обработки, который удаляет большинство липидов и жидкость в lipoaspirates, оставляя только СФДВ клетки и фракционированный ECM, который ECM/SVF-гель12. Здесь мы описываем подробности процесса механического человека производные жировой ткани производить ECM/SVF-гель.
Protocol
Representative Results
Discussion
На основе стволовых клеток регенеративной терапии показал большие потенциальные выгоды в различных заболеваний. ИСС являются выдающиеся лечебные кандидатов, потому что они легко получить и имеют потенциал для восстановления тканей и регенерации тканей Роман15. Однако су?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальный научный фонд природы Китая (81471881, 81601702, 81671931), фонд естественных наук в провинции Гуандун Китая (2014A030310155), и администратор Nanfang Больница фонда (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
- Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
- Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
- van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
- Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
- Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
- Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product – stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
- Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
- Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
- Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
- Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
- Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
- Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
- Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).
