Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Effekter av Blast-inducerad Neurotrauma på trycksatt gnagare mellersta cerebrala artärer

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/58792
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch, 2The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research, University of Texas Medical Branch

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva metoder för ex vivo vaskulär reaktivitet bestämning efter en primär blast traumatisk hjärnskada (bTBI) med hjälp av isolerade, trycksatt och gnagare mellersta cerebral arteriell (MCA) segment. bTBI induktion sker med hjälp av en shock tube, även känd som en avancerad Blast Simulator (ABS)-enhet.

Abstract

Även om det har gjorts studier på histopatologisk och beteendemässiga effekter av blast exponering, har färre tillägnats blast's cerebrala vaskulära effekter. Inverkan (dvs., icke-blast) traumatisk hjärnskada (TBI) är kända för att sänka trycket självregleringen i den cerebrala kärl hos både människor och försöksdjur. Hypotesen att blast-inducerad traumatisk hjärnskada (bTBI), som påverkar TBI, resulterar i försämrad cerebral vaskulär reaktivitet testades genom att mäta myogenic förhalande Svaren till reducerat intravaskulär tryck i gnagare mellersta cerebral arteriell (MCA) segment från råttor som utsätts för mild bTBI med hjälp av en avancerad Blast Simulator (ABS) chock röret. Vuxen, manlig Sprague-Dawley-råttor var sövda, intuberade, ventilerat och förberett för Sham bTBI (identiska manipulation och anestesi utom blast skada) eller mild bTBI. Råttor har randomiserats till Sham bTBI eller mild bTBI följt av offer 30 eller 60 min efter skada. Omedelbart efter bTBI, rätande reflex (RR) dämpning gånger bedömdes, dödshjälp på den tid punkter efter skadan slutfördes, hjärnan skördades och de enskilda MCA-segmenten samlades, monterad och trycksatt. Som intraluminal trycket perfusion via arteriell segment minskades i 20 mmHg steg från 100 till 20 mmHg, var MCA diametrar mäts och registreras. Med minskande intraluminal tryck, MCA diametrar stadigt ökat markant över baslinjen i Sham bTBI grupper medan MCA dilatator Svaren var signifikant (p < 0,05) i båda bTBI grupperna vilket framgår av den nedsatt, mindre MCA diametrar registreras för bTBI grupper. Dessutom RR dämpning i bTBI grupperna var signifikant (p < 0,05) högre än i Sham bTBI grupper. MCA är samlat från de Sham bTBI grupper utställda typiska vasodilaterande egenskaper för minskar i intraluminal trycket medan MCAS samlas in efter bTBI uppvisade signifikant nedsatt myogenic vasodilaterande Svaren till minskade trycket som kvarstod i minst 60 min efter bTBI.

Introduction

Liknande som följer av inverkan (dvs., icke-blast) TBI, blast-inducerad traumatisk hjärnskada (bTBI) har varit associerade med cerebral vaskulär skada1 och nedsatt cerebral vaskulär kompenserande Svaren till händelser som förändringar i partialtrycket av koldioxid (PaCO2)2,3,4 och syre (PaO2)5. Dessutom har blast exponering orsakade cerebral arteriell vasospasm i djur6 och bTBI patienter7,8. Medan kliniska TBI9 och vätska-slagverk skada (FPI)10,11,12 är associerade med försämrad cerebral vaskulär svar på förändringar i arteriellt blodtryck (dvs., Tryck självregleringen)9,10,11,12, osäkerhet kvarstår när det gäller effekterna av bTBI på cerebral kärltryck självregleringen kapacitet.

Den cerebral cirkulationen reagerar på variationer i systemiska arteriella trycket med avsikt att upprätthålla en kontinuerlig syre och näringstillförsel som levereras till den metaboliskt aktiva hjärnan13,14,15, 16. En unik typ av homeostas, självregleringen17,18,19 uppstår när ”ett organ upprätthåller en konstant blodflöde trots förändringar i blodtryck (perfusion) eller andra fysiologiska eller patologiska stimuli” 20. cerebrala artärer tygla eller vidgas svar på variationer i blodtryck, kväveoxid (NO), blodets viskositet, PaCO2 och PaO2etc.4,11,16, 21. arteriell myogenic svar avser sådana sammandragningar eller utspädningar. Den myogenic vaskulär respons, som först beskrevs av Bayliss22 och en viktig mekanism som bidrar till självregleringen av CBF, kännetecknas av vasokonstriktion om perfusionstrycket ökar och vasodilatation om perfusionstrycket minskar 14 , 17. detta vaskulär respons är kontraktila vävnader (t ex vaskulära glatta muskelceller, VSMC'S) inneboende förmåga att svara att sträcka och/eller förändringar i lumen eller vägg spänningen23,24, 25,26,27,28,29. När artärerna är sträckta (t.ex., under intravaskulär trycket ökar), VSMCS tygla24,25,26,28.

Studier som undersöker motstånd fartyg ex vivo har allmänt används en av två metoder för att testa den farmakologiska och fysiologiska egenskaper för isolerade motstånd fartyg: metoden ring-monterad och den kanylerade, trycksatt metod. Ring-monterad fartyget förberedelse metoden innebär att två trådar som gått intraluminally genom segmentet fartyg, som håller segmentet på plats. Mäta mängden kraft som anbringas på isometrically ihållande trådarna mätare stimulering av VSMC. Men denna teknik bär med sig vissa reservationer, framför allt, den oundvikliga skada som lidits av endothelial lagret av lumen när kablarna är passerade genom det30 och varierande grad av stretching av segmentet isolerade vilket i sin tur leder till fartyget vägg buk, som i slutändan påverkar fartygets känslighet för farmakologiska medel31. Den kanylerade, trycksatta fartyget förberedelse metoden använder tredjeparts en arteriograph som består av två separata kammare som varje hus placeringen av en mellersta cerebral arteriell (MCA) skördas från ett enskilt djur. En mikropipett infogas i varje ände av segmentet, den proximala änden av segmentet är fäst till mikropipett med suturer och lumen är mjukt perfusion med en fysiologisk saltlösning (PSS) för att eliminera blod och andra ämnen. Den distala änden fästs sedan med suturer. Transmural eller luminala tryckbärande ställs genom att höja de två reservoarer som bifogas varje pipett till lämplig höjd ovanför varje segment men på olika höjder med avseende på de andra32,33,34,35 ,36. Tryckgivare placerad längs reservoarer och Mikropipetter ge perfusion tryckmätningarna medan fartyg förstoras genom en inverterade Mikroskop har en monitor, video kamera och scaler som möjliggör mätning av externa MCA diametrar. Även om båda metoderna är värdefull, den kanylerade, trycksatta fartyget förberedelse metoden bättre härmar och tillstånd kärlen undersökas för att komma närmare deras in vivo villkor32,37.

Effekterna av olika typer av påverkan (dvs., icke-blast) TBI på cerebral vaskulär Svaren har tidigare studerats i cerebral arteriell segment21,35,36,38. Tidigare studier med liknande ex vivo MCA protokoll för fartyget insamling, montering och perfusion som beskrivs i den aktuella studien, och erhålls framgång med deras respektive utredningar av de associera mekanismerna av cerebral vaskulatur dysfunktion efter TBI. Golding et al.34 undersökta endothelial-medierad utspädningars vuxen, manlig lång-Evans råtta MCA efter svår TBI genom kontrollerad kortikal påverkan (CCI) skada. I en andra studie, Golding et al.36 undersökt cerebrovaskulär reaktivitet till hypotoni eller CO2 efter skörd MCAS från råttor som lidit en mild CCI. Yu et al.38 analyseras huruvida peroxynitrit asätare förbättrad förhalande svar på minskad intravaskulär trycket i vuxen, manlig Sprague-Dawley råtta MCA segment utsätts för FPI medan Mathew et al.21 studerade myogenic Svaren till hypotension hos MCA är skördas efter måttlig, centrala FPI.

För att bättre undersöka hypotesen att bTBI, som icke-blast TBI, resulterar i försämrad cerebral vaskulär reaktivitet, vi testade en mekanism som bidrar till komprometterad självregleringen genom att mäta myogenic förhalande Svaren till reducerat intravaskulär tryck ex vivo i isolerade, trycksatt gnagare MCA segment (figur 1) som samlats in från råttor som utsätts för mild bTBI använder en avancerad Blast Simulator (ABS) shock tube modell (figur 2 och figur 3) (se Rodriguez et al.39 Tabell 1) som använder tryckluft som levereras direkt till en drivrutin kammare att generera Freidlander-liknande40 över - och under - pressure vågor (se Rodriguez et al.39figur 1A).

Figure 1
Figur 1 : Platsen för mellersta cerebrala artärer (MCA). Ventral vy över råtthjärna markera platsen för MCAS i förhållande till den bakre cerebrala artärer (PCA), interna halspulsåder (ICA), yttre halspulsåder (ECA), basilaris artär (BA) och gemensamma halspulsåder (CCA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Avancerad Blast Simulator (ABS) shock tube enhet. ABS används för att producera primära blast skada i alla studie djur. 1 = föraren kammare; 2 = expansionskammare;  3 = prov kammare; 4 = reflekterade våg suppressor; gula stjärnor = preparatet fack. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla experimentella protokoll godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Texas Medical Branch, en förening för bedömning och ackreditering av laboratorier Djurvård (AAALAC) ackrediterade anläggning.

1. animaliskt förberedelse för ABS Blast skada

  1. Slå på mekaniska gnagare volym ventilatorn och Ställ andningsfrekvens mellan 40 – 45 andetag per minut.
  2. Switch termostatiskt kontrollerad värmande filt ON och tejpa en blå filtdyna över den.
  3. Fästa fläkt slang till ventilatorn.
  4. Samla endotrakeal intubering släde, laryngoskopet, länge pickup pincett, mandrängen endotrakealtub och en bomullstuss indränkt med 0,05 mL 1% lidokain HCl. Ordna på blå pad.
  5. Bekräfta att gnagare bedövningsmedel ”bubbla” kammare, ventilator, luftkammare och isofluran kammare slangarna ordentligt ansluten och knutna till deras respektive plug eller uttag. Bedövningsmedel bubbelkammare klämman ska vara öppen; ventilator klämman ska stängas.
  6. På luftkammare, Ställ vredet för rumsluften 2 L/min och vredet för syre till 1 L/min.
  7. Slå på isofluran och Ställ vredet till 4% av volymen blandning.
  8. Starta en timer och placera en ung vuxen (≈3 månader gamla), manliga Sprague-Dawley råtta (350 – 400 g) i narkos bubbla kammaren för 4 – 6 min.
  9. Väga råtta i 2 min märket.
  10. Bekräfta råtta är fullt anesthetized genom att försiktigt nypa hind tass tår. Om inga tass uttag observeras, minska luften och Ställ in vredet till 1 L/min, syre till 0,4 L/min och isofluran till 2% av volymen blandning.
  11. Slå på rektal registrerande fjärrtermometer temperaturvakt.
  12. Öppna klämman till ventilatorn och stäng klämman till narkos bubbla kammaren.
  13. Ta bort råtta från narkos bubbelkammare och position på endotrakeal intubering släde.
  14. Intubation råtta. Placera laryngoskopet i djurets mun, Använd långa pickup pincett när du placerar tungan ur vägen, provstickan lidokain-indränkt bomull svabb spets längs insidan av halsen och försiktigt in Mandrängen Innehållande endotrakealtub i råttans luftstrupen.
  15. När intuberade, ände ventilator slangen till utsidan slutet av endotrakealtub och iaktta och bekräfta råtta andas stadigt och utan svårighet.
  16. Knyta ner endotrakealtub in plats ta hand att tungan är fri från Knut.
  17. Applicera vit vaselin att Rektalblödning registrerande fjärrtermometer sonden och sätt direkt under svansen.
  18. Ta bort ABS preparatet facket från preparatet kammaren och placera under värmelampa för uppvärmningen innan råtta placering på bricka.
  19. Raka toppen av råttans hårbotten börjar ovanför ögonen och ner till mellan öronen.
  20. Skär en standardstorlek skum öra plugg i identiska halvor med sax. Börja i mitten av basen av kontakten och skär rakt upp till den runda sidan. Infoga en halverad bit i varje öra spets först längs hörselgången tills kontakt sker med trumhinnan.
  21. Övervaka rektaltemperatur. När en temperatur av 37 ° C har uppnåtts, är råtta redo att lastas i ABS preparatet facket.
  22. Säkra råtta på ABS preparatet facket. Ta bort respiratorn slangen från endotrakealtub och snabbt men mjukt Skjut råtta i den övre änden av facket, försiktigt vägleda huvudet genom rakhuvudshållaren öppning och gummikrage. Tillbaka ventilator slangen tillbaka in i endotrakealtub, kontrollera gummi halsbandet så att det är säkert men inte tätt runt halsen och verifierar att råttan är att lägga i en liggande sidoläge (figur 3).
  23. Stäng av isofluran och ta bort respiratorn slangen från endotrakealtub.
  24. Lås och säkra ABS preparatet facket som innehåller sövda råtta in i ABS preparatet kammaren.
  25. Försiktigt nypa hind paw tår med lång pincett varje 3 s tills ett tillbakadragande reflex svar framkallas.

2. ABS Blast enhet förberedelse och Blast-TBI induktion

Obs: Protokollstegen 2.1 – 2.10 färdigställs normalt samtidigt som steg 1,1 – 1,22 så ABS är redo för blast skada administration rätt efter råttan är lastad och säkrade in preparatet kammare.

  1. Lossa hydraulisk hand pumpen (figur 4A) vredet för att möjliggöra eventuella kvarvarande instängd luft fly från föraren kammaren (figur 4B) och att lossa kammaren från dess förseglar.
  2. Lossa locket muttrarna (figur 4C) från all-tråd stängerna (figur 4D) omger föraren kammaren och skjut kammaren till vänster och bort från expansionskammare (figur 4E).
  3. Helt ta bort två all-tråd stavar och deras motsvarande kupolmuttrar ligger högst upp på föraren avdelningen för att möjliggöra placering av mylar täcker mellan föraren och expansionskammare.
  4. Stack och tejp tillsammans längs övre kanten fyra före snittet och uppmätta (30 cm längd, bredd 20 cm, 0,004 tum tjock) mylar blad (bildar en mylar ' membran') med en 2,54 cm bit maskeringstejp. Använder en andra bit tejp, tejpa ordentligt den övre kanten av mylar membranet till toppen av expansionskammare och mitt över öppningen mellan föraren och expansion kamrarna (figur 4F).
  5. Säkra förare kammaren mot mylar membranet genom att ersätta två all-tråd stavar längst upp på avdelningen och hand-skärpning alla kupolmuttrar kring kammaren.
  6. Placera tillbehöret stålblockets mot hydraulisk hand pumpen block och driver kammaren tills säkert passa.
  7. Dra åt hydraulisk hand pumpen vredet och bekräfta driver kammaren förblir trycksatt med inga läckor genom att observera ett konstant tryck tröskelvärde på hydrauliska mätaren.
  8. Öppna filen utlösare förvärv som registrerar ABS blast enhet trycket spår på ABS blast enhet datorn.
  9. Lossa tryckluft tankens (figur 4G) huvudknappen nog något öppna luftvägarna.
  10. Driva den hydraulisk handpumpen tills indikatorn mätaren når den röda pilen anger en önskad kammare trycknivå av ≈5, 000 psi.
  11. Säkra och placera den sövda djuren på ABS preparatet facket (figur 4H) i en liggande sidoläge (figur 3) och låsa preparatet facket in i kammaren av ABS-exemplaret (figur 4jag).
  12. Försiktigt nypa en hind tass med lång pincett varje 3 s tills ett tillbakadragande reflex svar framkallas.
  13. Klicka på Start på sidan öppnade förvärv på ABS blast enhet datorn.
  14. När fönstret 'Acquisitioning' visas på skärmen, tryck på och håll ner den ABS blast enhetstrigger tills explosionen slocknar, spricker mylar membranet och administrera den ABS blast skadan (20,9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) till råtta. Direkt efter explosionen detonerar, starta en andra timer för att hålla koll på hur mycket tid (i min och s) förflutit efter skada.
  15. Ta bort råttan från ABS preparatet facket och återgå till blå filtdyna och värmande filt, placera honom fullt ut på hans rygg för bedömning av rätande reflex dämpning.
  16. Registrera tiden för återkomst den rätande reflexen. Att observera andra timern, dokument i min och s hur lång tid efter skada som det tar för råttan att rulla från rygg till sin mage tre på varandra följande gånger. Återgå till råtta till narkos bubbla kammaren.
  17. Lossa hydraulisk hand pumpen vredet för att möjliggöra driver kammare lossa och rörelse.
  18. Dra åt tryckluft tankens huvudknappen för att stänga luftvägarna.

Figure 3
Figur 3 : Råtta placering på ABS preparatet bricka och släpper ABS. Riktning och orientering av studien djur släpper ABS. När den placeras i ABS, är djuret i en tvärgående liggande position med den dorsala ytan av huvudet vinkelrätt mot chock våg (Röda pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Avancerad Blast Simulator (ABS) shock tube enhet Schematisk. Huvudkomponenterna på ABS. A = hydraulisk handpump; B = föraren kammare; C = kupolmuttrar; D = all-tråd stavar;  E = expansionskammare; F = läge av mylar membran placering; G = komprimerad luftcylindrar; H = preparatet bricka; Jag = prov kammare.  Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

3. beredning av gnagare MCA PSS lösning

Obs: Protokollstegen 3.1 – 3.3 färdigställs normalt samtidigt som steg 1,1 – 1,22 till har PSS lösningen är klar för användning.

  1. Förbereda och blanda en 1 000 mL fysiologisk saltlösning (PSS) av följande sammansättning och koncentrationer: 130 mM NaCl. 4.7 mM KCl; 1.17 mM MgSO4∙7H2O; 5 mM glukos; 1,5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3.
  2. Temperera PSS med en gasblandning av 21% O2 och 5% CO2 i en balans av N2. Lösningen är klar när pH läser 7,4.
    Obs: Alla gaser erhålls från komprimerad gasflaskor i de ovan nämnda koncentrationerna.
  3. Fyll på behållaren flaskor och slangar med beredd PSS lösning och chill återstående lösningen.

4. utvinning av gnagare MCA segment

  1. Efter dokumentera hur länge den rätande reflex, återvända råtta till narkos bubbla kammaren. Stäng klämman till ventilatorn och öppna klämman till kammaren. Sväng av isofluran vidare till 4% av volymen blandning och håll råttan i kammaren för 2 – 3 min tills djupt sövda.
  2. När råttan är sövda, öppna klämman till ventilatorn och stäng klämman till narkos bubbla kammaren. Minska isofluran till 2% av volymen blandning, och ta bort honom från bubbla kammaren. Placera honom på magen på den värmande filten och Stick in änden ventilator till utsidan slutet av endotrakealtub.
  3. Upprätthålla mekanisk ventilation på en andningsfrekvens mellan 40 – 45 andetag per minut och anestesi på 2% av volymen blandning för antingen 30 eller 60 min omedelbart post-bTBI skada.
  4. Efter slutförandet av antingen 30 eller 60 min överlevnadstid, öka isofluran till 4% av volymen blandning, och djupt söva för 5 – 6 min. omedelbart avliva genom halshuggning med en gnagarspecifika giljotin.
    Obs: I dessa experiment höll vi djuren bedövas och mekaniskt ventilerade efter återlämnande av rätande reflex till halshuggning.  Om studien kräver längre överlevnad tidpunkter, bör analgetika ges till djuret innan uppkomsten från anestesi.
  5. Ta försiktigt bort hjärnan från skallen. Använd en #10 skalpell blad för att göra en central, 1,5 tum vertikalt, ben djup snitt från toppen av Rakad hårbotten ner till den occipital condylen.
  6. Använd små ben rongeurs öppna och separera hårbotten huden från skallbenet.
  7. Använd stort ben rongeurs att skära och extrahera occipital, interparietal och nedre halvan av de pannben innesluta hjärnan.
  8. Använd en kirurgisk spatel för att försiktigt gräva hjärnan ur skallen när hjärnan är gratis för omgivande ben.
    Obs: Ta extrem försiktighet när separera hjärnan från skallen så att inte onödigt bogserbåt, jerk eller dra känsliga MCA segment från kraniala väggen.
  9. Sätta in skördade hjärnan på den kylda PSS lösningen i ett litet glas petriskål som vilar direkt ovanpå en solid isblock.
  10. Ta försiktigt bort både vänster och höger MCA början på den Circle of Willis. Fortsätta att ta bort segmentet sidled och dorsalt för cirka 4 – 5 mm.
  11. Försiktigt rengöra insamlade MCA segment av cirka 4 – 5 mm i längd av någon bindväv som använder microforceps.
  12. Montera MCAS på arteriograph. Cannulate den proximala änden av varje segment med den första glas mikropipett (diameter ≈70 µm) och säkra med en 10-0 nylon sutur.
  13. Mjukt BEGJUTA lumina med PSS att ta bort eventuella kvarvarande blod och annat innehåll från lumen.
  14. Cannulate den distala änden av varje segment med den andra mikropipett utan stretching segmentet MCA och säkra med en 10-0 nylon sutur.
  15. Efter framgångsrika montering av MCA-segmentet, placera kammaren ovanpå en inverterad mikroskopets scenen för förstoring av fartygen. Mikroskopet är utrustad med en videokamera, monitor och en video scaler kalibreras med en optisk mikrometer för arteriell diameter mätningar.
  16. Fyll varje segment och omgivande arteriograph badet med kontinuerligt cirkulerade PSS värmas från rumstemperatur till 37 ° C och jämviktas med gasblandningen av 21% O2 och 5% CO2 i en balans av N2.
  17. Temperera segmenten MCA vid ett tryck på 50 mmHg för 60 min genom att höja reservoar flaskorna ansluten till Mikropipetter till lämplig höjd ovan segment. Tryckgivare som ligger mellan Mikropipetter och reservoar flaskor kommer bedöma transmural tryck inom segmentet MCA som anger när önskat 50 mmHg tryck uppnås.
  18. Efter avslutningen av perioden Jämviktstiden, öka intravaskulär trycket till 100 mmHg genom att ange den reservoar flaskor i olika höjder.
  19. Leverera 30 mM K+ (för bekräftelse av fartyget kontraktion) via den luminala perfusatet och åtgärd arteriell diametrar. Cirka 10 min senare leverera 10-5 M Ach (för fartyget dilatation) och mäta arteriell diametrar.
  20. Undersöka fartyget förhalande svar. Lägre reservoar flaskorna att minska intravaskulär trycket från 100 mmHg till 80 mmHg. Tillåta segmenten MCA temperera för 10 min. mått arteriell diametrar.
  21. Minska det intravaskulära trycket från 80 mmHg till 60 mmHg. Tillåta segmenten MCA temperera för 10 min. mått arteriell diametrar.
  22. Minska det intravaskulära trycket från 60 mmHg till 40 mmHg. Tillåta segmenten MCA temperera för 10 min. mått arteriell diametrar.
  23. Minska det intravaskulära trycket från 40 mmHg till 20 mmHg. Tillåta segmenten MCA temperera för 10 min. mått arteriell diametrar.

Representative Results

Genomsnittlig bTBI övertryck för alla studie djur var 20,9 psi ±1.14 (138 kPa ±7.9). Genomsnittlig löptid rätande reflex (RR) dämpning för råttor som utsätts för ABS bTBI shockwave exponering (5.37 min ±2.1) var inte signifikant längre (p = 0,36, bTBI vs. sham) än i gruppen sham (5.10 min ±1.6).

I både 30 och 60 min sham grupper ökat MCA diametrar över baslinjen liksom intraluminal trycket sänktes från 100 till 20 mmHg. MCA förhalande svar på kontinuerlig jämfört med deras motsvarande sham-grupper, och införde minskning av intravaskulär trycket i den observerade 30 min (p = 0,01, bTBI vs. sham) och 60 min (p = 0,02, bTBI vs. sham) ABS bTBI grupperna var betydligt efter blast exponering (figur 5). För en mer detaljerad diskussion av dessa resultat, se Rodriguez et al.39.

Dessa studier visade att mild bTBI betydligt nedsatt cerebral kompenserande dilatator Svaren till reducerat intravaskulär tryck i MCA segment 30 och 60 min efter mild bTBI medan de milda chockvåg nivåer som används i dessa studier resulterade i löptider dämpning av RR (< 30 s) liknar dem hos sham-skadade råttor.

Statistiska analyser utfördes med programvara. Myogenic svar på förändringar i tryck för intravaskulär bedömdes genom att beräkna procentuell förändring från baslinjen (100 mmHg) för varje nivå av intraluminal tryck (80, 60, 40 och 20 mmHg). Oparade Student's t-test användes för att utvärdera skillnaderna mellan bTBI och sham gruppen baslinjer. Skillnader i MCA dilatator Svaren mellan bTBI och sham grupper utvärderades med en upprepad envägs variansanalys (ANOVA) Dunnetts flera jämförelser test och en Bartlett's test för lika varians.

På grund av minskade statistiska kraft som resulterar från upprepade tester, jämförelser på varje specifik tryckpunkt i MCA experiment (t.ex., mellan 100-80 mmHg eller mellan 60 och 40 mmHg, etc.) har inte utförts. Betydelse blev antagen vid det p ≤ 0,05 nivå. Alla data i text, refererade tabellen och figur uttrycks som betyder ± standardfel medel (SEM).

Figure 5
Figur 5 : Effekter av bTBI på mellersta cerebral arteriell (MCA) Svaren till reducerat intravaskulär tryck. Dilatator Svaren till progressiva minskningar av intravaskulär trycket uppvisade nedsatt vasodilaterande svaren och betydligt i 30 min (p = 0,01, bTBI vs. sham) och 60 min (p = 0,02, bTBI vs. sham) bTBI grupper (n = 6/grupp) efter blast exponering jämfört med både Sham grupper (n = 12). I både 30 och 60 min sham grupper ökat MCA diametrar över baslinjen liksom intraluminal trycket sänktes från 100 till 20 mmHg. Värden är ritade som betyder ± SEM. *p < 0,05 vs. sham. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Som med alla protokoll och instruktioner, är det absolut nödvändigt att vissa steg för protokollet i denna särskilda undersökning följs så exakt och så exakt som möjligt. Efter den inledande intubation av råtta är det viktigt att bekräfta att det är att andas lugnt och utan svårighet. Av misstag sätter endotrakealtub i matstrupen i stället för luftstrupen resulterar i rasping, svårt andetag, blödning och den efterföljande medryckande råttans på grund av bristfällig smärtlindring leverans till lungorna.

När tejpning mylar membranet täcker över centrum av öppningen mellan föraren och expansion kammaren, är det nödvändigt att arken är centrerade och täcker hela öppning39,41. Misaligning täcker över öppningen kommer att resultera i luftläckage från föraren kammaren, en droppe i erforderligt tryck för burst-membranpotentialen och förnekande av administrationen av den blast skadan. Korrekt placera och säkert passande tillbehör stål blocket mot hydraulisk handpump block och föraren avdelningen är också viktigt som är åtdragning hydraulisk hand pumpen vredet och bekräftar driver kammaren förblir trycksatt utan läckor. Korrekt placering av stålblockets tillåter föraren kammaren till tätt nära mot den expansionskammare, vilket skapar den obligatoriska tätningen krävs över kammaren öppning av Mylar membran arken och mellan föraren och expansion kammaren.

Under förberedelserna innan de MCA fartyget extraktioner, gasning PSS med nödvändiga blandningen av 21% O2 och 5% CO2 i en balans av N2 balanserar lösningen och underlättar necessitated neutrala fysiologiska pH behövs för en arbetar PSS lösning21,33,34.

Equilibrating segmenten på ett konstant tryck för 60 min21,32,33,34 är extremt obligatoriskt eftersom detta steg tillåter segmenten att tygla följande en maximal dilatation visas under deras första primära trycksättning. Denna händelse visar förekomsten av spontana tonen, en egenskap som tyder på en frisk artär32,33,34. Även om diverse trycknivåer för segmentet Jämviktstiden använts i andra studier33,34,42, denna studie och de av Mathew et al.21, Golding et al.35 och Golding et al.43 jämviktas segmenten på 50 mmHg. Medan equilibrating insamlade segment någonstans mellan 40 mmHg – 100 mmHg32 möjliggör vissa flexibilitet och modifiering för steget i protokollet, en Jämviktstiden timmarsperiod inom de parametrarna som tryck slutligen bekräftar friska artärer behövs för fortsätta experimentet.

Ta extrem försiktighet när du tar bort hjärnan från skallen och de vänstra och högra MCA-segment från den Circle of Willis samtidigt som dessa fartyg intakt är kanske det viktigaste steget i hela protokollet. Punktera hjärnan med den ben rongeurs, kommer att riva eller svår stretching av segmenten under borttagning eller av misstag dra kärlen med kirurgisk spateln när grävning hjärnan ur skallen slutändan resultera i förstörelsen av den avver- MCA'S, orsakar oanvändbar segment och avbröt användning av denna uppsättning artärer, slutligen tömning hela experimentet för detta djur.

Även mäta cerebral vaskulär Svaren till förhalande eller constrictory stimuli i MCA segment ex vivo samlas in efter effekt eller blast TBI Invivo har gett framgång, är metoden inte utan dess svårigheter eller begränsningar. Kanske en av mer märkbara komplexiteten kopplad till att undersöka konsekvenserna av TBI om avyttring av de cerebrala kärl du lossar TBI explicit effekter på fartyg från implicita effekterna som uppstår på grund av de olika material och element som genereras av de skada hjärnan44. Denna tänkbara rådlöshet kan potentiellt kringgås genom att analysera ex vivo vasoconstrictory och vasodilaterande reaktioner skördas, perfusion och/eller trycksatt MCA'S. I ett försök att minska varaktigheten av tid som cerebrala artärer i vivo utsätts för lokalt urladdat parenkymal vasoaktiva materialet före döden, samling av cerebrala artärer direkt efter TBI kan minska graden av sådan långvarig exponering effekter. Ex vivo-studier på isolerade MCAS dessutom presentera utsikterna att analysera mekanismer av traumatisk vaskulär skada genom användning av särskilda receptoragonister och antagonister eller välrenommerade fordon av vaskulär skada som inte skulle ha råd med granskning som effektivt eller som diskriminerande i vivo. Därefter kan detta ex vivo metoden kombineras med ex vivo exponering för droger att testa resulterande myogenic svaren (vasokonstriktion eller dilatation av kärl segment på grund av intravaskulär eller extravaskulär läkemedelsexponering).

Andra begränsningar är ungefär eller otåligt att ta bort MCAS från skördade hjärnan vilket kan resultera i förtida avrivning av fartygen, således upphäva deras användning. Dessutom att låta mer än ett par minuter förflyta mellan avlivning av djuret, samling av fartygen och deras placering i den beredda PSS-lösningen kan också att förneka deras livskraft. När korrekt utfört och följde, kan de metoder som beskrivs i detta protokoll för provning av MCA'S myogenic svar efter bTBI tar flera timmar från början till slut och försök till inskränka tidsperiod som krävs för framgång resultera i experimental misslyckande. Men denna metod är gjort in vitro- och utnyttjar betydligt mer kostnadseffektiv instrumentering och utrustning än Invivo högupplösta magnetresonans (MR) imaging45,46 eller konventionella Doppler sonography / velocimetric tekniker47,48,49 som också är anställd för fartyget studier.

Dessa fynd att mild bTBI skada är associerade med försämrad cerebral förhalande Svaren till reducerat intravaskulär tryck kan potentiellt vara en funktion av vasospasm6,7 och VSMC hyperconstriction50 tidigare rapporterade efter blast exponering som i slutändan leder till förekomster såsom minskad relativ cerebral perfusion. Dessutom kunde blast-inducerad skada hindrar normala förhalande reaktioner av de cerebrala vaskulatur möjligen främja ytterligare sänkningar av cerebral perfusion i kombination med arteriell hypotension, en frekvent förekomst under stridsoperationer.

Dessa resultat indikerar att bTBI resulterar i en förändring till de mekanismer som underlättar arteriell vaskulär kontroll. Även om akut-fas cerebral vaskulär försämring av arteriell myogenic svar på minskningar av intravaskulär trycket för minst en timme efter skada observerades, fortfarande finns luckor i informationen kring den akuta fasen efter bTBI. Vikten av att identifiera vilka fysiska och biokemiska brister skador att den cerebrala vaskulatur och hjärnan exponering för bTBI orsaker kunde stöd i fastställandet av terapeutiska och rehabiliterande framgång ganska omedelbart efter skada.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Studier avslutades som en del av ett team som stöds av The Moody Project för translationell traumatisk skada hjärnforskning och W81XWH-08-2-0132 award från US Army Medical Research och Material kommando - försvarsdepartementet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Blast Simulator (ABS) Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. N/A Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries 
Adult, male, Sprague-Dawley rats  Charles River Laboratories N/A Experimental animals
Arteriograph Living Systems Instrumentation, Inc. Arteriograph Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter 
Bone rongeurs, large FST Fine Science Tools Friedman Rongeur Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small FST Fine Science Tools Boynton Rongeur Brain extraction from skull
CaCl2  Sigma Calcium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs 3M Foam Ear Plugs 1100 Class AL  Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine 
Glucose Sigma D-[+]-Glucose Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane  Piramal Enterprises Limited  Isoflurane, USP Anesthetic
KCl Sigma Potassium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO4•7H2O  Sigma Magnesium sulfate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps Buxton Biomedical Inc. Micro Tying Fcps, 180mm Brain extraction from skull
Mylar sheets Texas Art Supply Mylar Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl Sigma Sodium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO3 Sigma Sodium bicarbonate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture Ethicon 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter      
Scalpel blade #10 Bard-Parker 10 Stainless Steel Surgical Blade Brain extraction from skull
Surgical spatula Delmaks Surgico Cement Spatula  Brain extraction from skull
Thermometer  Physitemp Instruments, Inc.,  Thermalert Monitoring Thermometer Monitoring of experimental animal's core body temperature 
Volume ventilator  Harvard Apparatus, Inc. Small Animal Ventilator Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket Gaymar Industries, Inc.  Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad Maintenance of experimental animal's body temperature 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Blast-induced brain injury and posttraumatic hypotension and hypoxemia. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 877-887 (2009).
  2. Overgaard, J., Tweed, W. A. Cerebral circulation after head injury. Part 1: CBF and its regulation after closed head injury with emphasis on clinical correlations. Journal of Neurosurgery. 41 (5), 531-541 (1974).
  3. Wei, E. P., Dietrich, W. D., Povlishock, J. T., Navari, R. M., Kontos, H. A. Functional, morphological, and metabolic abnormalities of the cerebral microcirculation after concussive brain injury in cats. Circulation Research. 46 (1), 37-47 (1980).
  4. Wei, E. P., Kontos, H. A., Patterson, J. L. Dependence of pial arteriolar response to hypercapnia on vessel size. The American Journal of Physiology. 238 (5), 697-703 (1980).
  5. Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Effects of experimental fluid percussion injury of the brain on cerebrovascular reactivity of hypoxia and to hypercapnia. Journal of Neurosurgery. 56 (3), 332-338 (1982).
  6. Bauman, R. A., et al. An introductory characterization of a combat-casualty-care relevant swine model of closed head injury resulting from exposure to explosive blast. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 841-860 (2009).
  7. Armonda, R. A., et al. Wartime traumatic cerebral vasospasm: recent review of combat casualties. Neurosurgery. 59 (6), 1215-1225 (2006).
  8. Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 815-825 (2009).
  9. Bouma, G. J., Muizelaar, J. P. Relationship between cardiac output and cerebral blood flow in patients with intact and with impaired autoregulation. Journal of Neurosurgery. 73 (3), 368-374 (1990).
  10. Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Autoregulation of cerebral blood flow after experimental fluid percussion injury of the brain. Journal of Neurosurgery. 53 (4), 500-511 (1980).
  11. DeWitt, D. S., et al. Effects of fluid-percussion brain injury on regional cerebral blood flow and pial arteriolar diameter. Journal of Neurosurgery. 64 (5), 787-794 (1986).
  12. Engelborghs, K., et al. Impaired autoregulation of cerebral blood flow in an experimental model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 17 (8), 667-677 (2000).
  13. Mchedlishvili, G. Physiological mechanisms controlling cerebral blood flow. Stroke. 11 (3), 240-248 (1980).
  14. Kontos, H. A. Regulation of the cerebral circulation. Annual Review of Physiology. 43, 397-407 (1981).
  15. Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr The consequences of traumatic brain injury on cerebral blood flow and autoregulation: a review. Clinical and Experimental Hypertension. 21 (4), 299-332 (1999).
  16. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Traumatic cerebral vascular injury: the effects of concussive brain injury on the cerebral vasculature. Journal of Neurotrauma. 20 (9), 795-825 (2003).
  17. Paulson, O. B., Strandgaard, S., Edvinsson, L. Cerebral autoregulation. Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews. 2 (2), 161-192 (1990).
  18. Lang, E. W., Diehl, R. R., Mehdorn, M. Cerebral autoregulation testing after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: the phase relationship between arterial blood pressure and cerebral blood flow velocity. Critical Care Medicine. 29 (1), 158-163 (2001).
  19. Soehle, M., Czosnyka, M., Pickard, J. D., Kirkpatrick, P. J. Continuous assessment of cerebral autoregulation in subarachnoid hemorrhage. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 1133-1139 (2004).
  20. Roy, C. S., Sherrington, M. B. On the regulation of the blood-supply of the brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
  21. Mathew, B. P., DeWitt, D. S., Bryan, R. M., Bukoski, R. D., Prough, D. S. Traumatic brain injury reduces myogenic responses in pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Neurotrauma. 16 (12), 177-186 (1999).
  22. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
  23. Johnson, P. C., Henrich, H. A. Metabolic and myogenic factors in local regulation of the microcirculation. Federation Proceedings. 34 (11), 2020-2024 (1975).
  24. Johnson, P. C. The myogenic response and the microcirculation. Microvascular Research. 13 (1), 1-18 (1977).
  25. Atkinson, C. L., et al. Opposing effects of shear-mediated dilation and myogenic constriction on artery diameter in response to handgrip exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 119 (8), 858-864 (1985).
  26. Johnson, P. C. The myogenic response in the microcirculation and its interaction with other control systems. Journal of Hypertension. 7 (4), Supplement 33-39 (1989).
  27. Allen, S. P., Wade, S. S., Prewitt, R. L. Myogenic tone attenuates pressure-induced gene expression in isolated small arteries. Hypertension. 30 (2), Pt 1 203-208 (1997).
  28. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  29. Ahn, D. S., et al. Enhanced stretch-induced myogenic tone in the basilar artery of spontaneously hypertensive rats. Journal of Vascular Research. 44 (3), 182-191 (2007).
  30. Demay, J. G., Gray, S. D. Endothelium-dependent reactivity in resistance vessels. Progress in Applied Microcirculation. 8, 181-187 (1985).
  31. Nilsson, H., Sjöblom, N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat. Acta Physiologica Scandinavica. 125, 429-435 (1985).
  32. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  33. Bryan, R. M., et al. Stimulation of α2 adrenoreceptors dilates the rat middle cerebral artery. Anesthesiology. 85, 82-90 (1996).
  34. Golding, E. M., et al. Endothelial-mediated dilations following severe controlled cortical impact injury in the rat middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (8), 635-644 (1998).
  35. Golding, E. M., Contant, C. F., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Temporal effect of severe controlled cortical impact injury in the rat on the myogenic response of the middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (11), 973-984 (1998).
  36. Golding, E. M., et al. Cerebrovascular reactivity to CO(2) and hypotension after mild cortical impact injury. The American Journal of Physiology. 277 (4), Pt 2 1457-1466 (1999).
  37. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  38. Yu, G. X., et al. Traumatic brain injury in vivo. and in vitro. contributes to cerebral vascular dysfunction through impaired gap junction communication between vascular smooth muscle cells. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 739-748 (2014).
  39. Rodriguez, U. A., et al. Effects of mild blast traumatic brain injury on cerebral vascular, histopathological and behavioral outcomes in rats. Journal of Neurotrauma. 35 (2), 375-395 (2018).
  40. Friedlander, F. G. The diffraction of sound pulses; diffraction by a semi-infinite plane. Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Mathematical and Physical Sciences. 186 (1006), 322-344 (1946).
  41. Tompkins, P., et al. Brain injury: neuro-inflammation, cognitive deficit and magnetic resonance imaging in a model of blast induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1888-1897 (2013).
  42. Cipolla, M. J., Vitullo, L., McKinnon, J. Cerebral artery reactivity changes during pregnancy and the postpartum period: a role in eclampsia. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2127-2132 (2004).
  43. Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr Comparison of the myogenic response in rat cerebral arteries of different calibers. Brain Research. 785 (2), 293-298 (1998).
  44. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Assessment of cerebral vascular dysfunction after traumatic brain injury. Animal Models of Acute Neurological Injuries II: Injury and Mechanistic Assessments. , Humana Press. New York. (2012).
  45. Degnan, A. J., et al. MR angiography and imaging for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic disease. American Journal of Neuroradiology. 33 (8), 1427-1435 (2012).
  46. Liu, Q., et al. Comparison of high-resolution MRI and CT angiography and digital subtraction angiography for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic steno-occlusive disease. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 29 (7), 1491-1498 (2013).
  47. Newell, D. W., Winn, H. R. Transcranial Doppler in cerebral vasospasm. Neurosurgery Clinics of North America. 1 (2), 319-328 (1990).
  48. Schenone, M. H., Mari, G. The MCA Doppler and its role in the evaluation of fetal anemia and fetal growth restriction. Clinics in Perinatolgy. 38 (1), 83-102 (2011).
  49. Morris, R. K., Say, R., Robson, S. C., Kleijnen, J., Khan, K. S. Systemic review and meta-analysis of middle cerebral artery Doppler to predict perinatal wellbeing. European Journal of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology. 165 (2), 141-155 (2012).
  50. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12705-12710 (2011).

Tags

Neurovetenskap fråga 146 TBI blast-inducerad traumatisk hjärnan skada (bTBI) blast-inducerad neurotrauma primära blast skada cerebral vaskulär reaktivitet mellersta cerebrala artärer (MCA) myogenic svar
Effekter av Blast-inducerad Neurotrauma på trycksatt gnagare mellersta cerebrala artärer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, … More

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter