Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine
Summary
Cordone ombelicale umano (UC) possono essere ottenuti durante il periodo perinatale a seguito di termine prematuro e postterm consegna. In questo protocollo, descriviamo l’isolamento e la caratterizzazione di UC-derivati di cellule staminali mesenchimali (MSCs-UC) da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.
Abstract
Cellule staminali mesenchimali (MSCs) hanno un notevole potenziale terapeutico e attrarre l’interesse crescente in campo biomedico. MSCs sono originariamente isolato e caratterizzato dal midollo osseo (BM), poi acquisita da tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB) e del cordone ombelicale (UC). MSCs sono una popolazione eterogenea delle cellule con la capacità per (1) l’adesione alla plastica in condizioni di coltura standard, espressione di marcatori (2) superficie di CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenotipi /HLA-DR– –e (3) trilineage differenziazione in adipociti, osteociti e condrociti, come attualmente definiti dalla società internazionale per la terapia cellulare (ISCT). Sebbene BM è la fonte più ampiamente usata di MSCs, la natura invasiva di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l’età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da UC hanno vantaggi come la capacità di differenziazione e proliferazione vigorosa. Non c’è nessuna preoccupazione etica per il campionamento di UC, come è in genere considerato come rifiuti sanitari. UC umano inizia a sviluppare con la continua crescita della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione e continua a crescere fino a raggiungere 50-60 cm di lunghezza, e può essere isolato durante il periodo di consegna tutto neonato. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, abbiamo usato UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale. In questo protocollo, descriviamo l’isolamento e la caratterizzazione di UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.
Introduction
Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono originariamente isolate e caratterizzata dal midollo osseo (BM)1,2 , ma può essere ottenute anche da una vasta gamma di tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali 3. MSCs sono riconosciuti come una popolazione cellulare eterogenea che può proliferare e differenziarsi in condrociti, osteociti e adipociti. Inoltre, MSCs possiedono la capacità di migrare verso luoghi della ferita, sopprimere e modulare le risposte immunitarie e ritoccare e riparare le lesioni. Attualmente, MSCs da diverse fonti hanno attirato l’interesse crescente come una fonte per la terapia cellulare contro un certo numero di malattie intrattabili, compreso la malattia dell’innesto – contro – ospite, infarto miocardico e infarto cerebrale4,5 .
Sebbene BM è la fonte più ben caratterizzata di MSCs, l’invasività di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l’età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB), e del cordone ombelicale (UC) hanno vantaggi tra cui meno etiche preoccupazioni per quanto riguarda il campionamento e robusta la proliferazione e differenziazione capacità6 , 7. tra annessi fetali che solitamente vengono scartati come rifiuti sanitari, UCB e UC sono considerati un organo fetale, mentre la placenta è considerata di fetomaternal. Inoltre, placenta e UCB devono essere provati e raccolti nel momento esatto di consegna neonato, considerando che la placenta e UC possono essere raccolti ed elaborati dopo la consegna del neonato. Di conseguenza, UC è una promettente fonte MSC per terapia cellulare8,9.
UC umano inizia a sviluppare con la progressiva espansione della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione, continua a crescere fino a 50-60 cm di lunghezza e possono essere isolati durante tutto il periodo di consegna neonato10. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, usiamo UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale11,12. In questo protocollo, descriviamo come isolare e caratterizzare UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs può essere isolato da una varietà di tessuti e sono una popolazione eterogenea di cellule che fare express non tutti gli stessi marcatori fenotipici. Qui, abbiamo delineato un protocollo che guida la raccolta e la dissezione di UC dai neonati pretermine e a termine e consente l’isolamento e la coltura di UC-MSCs. A seguito di questo protocollo, abbiamo isolato correttamente UC-MSCs che soddisfano i criteri ISCT19 da OSSC trasportato a 19-40 settimane di gestazione e ha dimostrato che rappre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per Scientific Research (C) (concessione numero: 25461644) e giovani scienziati (B) (concedere numeri: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) di JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
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