Cordon ombilical humain (UC) peuvent être obtenu au cours de la période périnatale à la suite de terme prématuré et postterm de livraison. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC dérivées de cellules souches mésenchymateuses (UC-MSCs) du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.
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Article de méthode
Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel thérapeutique considérable et susciter un intérêt croissant dans le domaine biomédical. MSCs sont initialement isolés et caractérisés de la moelle osseuse (BM), puis acquis de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices fœtales comme le placenta, cordon ombilical (UCB) et du cordon ombilical (UC). MSCs sont une population hétérogène de cellules ayant la capacité (1) l’adhérence sur plastique dans des conditions de culture standard, expression du marqueur (2) surface de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Phénotypes /HLA-DR– –et (3) trilineage différenciation en adipocytes et ostéocytes chondrocytes, tel qu’il est définis par la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT). Bien que BM est la source plus largement utilisée de MSCs, le caractère invasif d’aspiration BM limite éthiquement son accessibilité. Capacité de prolifération et la différenciation de MSCs provenant de la BM en général diminuent avec l’âge du donateur. En revanche, MSCs fœtales obtenues UC possèdent des avantages tels que la prolifération vigoureuse et capacité de différenciation. Il n’y a aucun souci éthique pour l’échantillonnage de l’UC, car elle est généralement considérée comme les déchets médicaux. UC humaine commence à se développer avec la croissance de la cavité amniotique à 4-8 semaines d’âge gestationnel continue et continue de croître jusqu'à atteindre 50 à 60 cm de longueur, et il peut être isolé pendant le délai de livraison tout nouveau-né. Pour mieux comprendre la physiopathologie des maladies incurables, nous avons utilisé des dérivés UC MSCs (UC-MSCs) de nourrissons livrés à divers âges gestationnels. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC-MSCs du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.
Introduction
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont initialement isolés et caractérisé de la moelle osseuse (BM)1,2 mais peut également être obtenues d’une grande variété de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices foetales 3. MSCs sont reconnus comme une population de cellules hétérogènes qui peut proliférer et se différencier en adipocytes et ostéocytes chondrocytes. En outre, MSCs possèdent la capacité de migrer vers des sites de blessures, de réprimer et de moduler les réponses immunitaires et remodeler et de réparer la blessure. Actuelleme....
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Protocole
L’utilisation d’échantillons humains pour cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de Kobe University Graduate School of Medicine (agrément n° 1370 et 1694) et conformes aux principes directeurs adoptés.
1. isolement et Culture des UC-MSCs
Remarque : UC-MSCs ont été correctement isolées, cultivées, et élargie (plus de numéro de passage 4) de plus de 200 UCs soumis au présent protocole. Parmi plus de 200 UCs, 100 % ont montré des réussite de l’isolement UC-MSC, moins de 5 % ont montré une contamination accidentelle, de moins de 15 % ont montré l’arrestation de croissance, et plus de 80 % ....
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Résultats
Les procédures de collecte de l’UC à la culture MSC sont résumées dans la Figure 1. UC d’environ 5-10 cm de longueur peut être prélevé sur tous les nouveaux-nés par césarienne. UC commence à se développer à 4-8 semaines de gestation et ne cesse de croître jusqu'à 50-60 cm de longueur, comme illustré à la Figure 2. Il existe deux artères (A), une veine (V), doublure de cordon (CL) et gelée de Wharton (WJ) en UC, comme illustré à l.......
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Discussion
MSCs peuvent être isolés dans une variété de tissus et sont une population hétérogène de cellules qui font express pas tous les mêmes marqueurs phénotypiques. Ici, nous avons décrit un protocole qui les guides de la collection et la dissection des UC de nouveau-nés prématurés et à terme et permet l’isolement et la culture de UC-MSCs. Suite à ce protocole, nous avons isolé avec succès UC-MSCs qui remplissent les critères ISCT19 de foetus/les enfants livrés à 19 à 40 semaines de gestation et démontr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions pour Scientific Research (C) (numéro de licence : 25461644) et de jeunes scientifiques (B) (accorder des numéros : 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube en plastique de 50 mL | AS One Coporation, Osaka, Japon | Violamo 1-3500-22 | |
| Plaque à 12 puits | AGC Techno Glass, Tokyo, Japon | Iwaki 3815-012 | |
| Antenne parabolique de 60 mm | AGC Techno Glass, Tokyo, Japon | Iwaki 3010-060 | |
| Crépine à cellules (100 &mu ; m) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ; | Falcon 35-2360 | |
| Crépine à cellules (70 &mu ; m) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ; | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japon | 135-15175 | |
| Sérum fœtal bovin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Sérum réduit moyen | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotique-antimycosique | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ; | Gibco 15240-062 | |
| Trypsine-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japon | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga, Japon | T900 | |
| Mélanges d’enzymes purifiées | Roche, Mannheim, Allemagne | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| Anticorps primaire de souris conjugué au PE contre CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot : 3220644, RRID : anticorps |
| primaire de souris conjugué au PE AB_400312 contre CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot : 3198741, RRID : anticorps |
| primaire de souris AB_400018 conjugué au PE contre CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot : 3079912, RRID : anticorps |
| primaire de souris AB_396151 conjugué au PE contre CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot : 2300520, RRID : anticorps primaire de |
| souris conjugué au PE AB_395875 contre CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot : 3057778, RRID : AB_393561 |
| Anticorps primaire de souris conjugué au PE contre CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot : 3128616, RRID : anticorps primaire de |
| souris conjugué au PE AB_395970 contre CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot : 4339624, RRID : AB_2033932 |
| Anticorps primaire de souris conjugué au PE contre HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot : 3219843, RRID : AB_400293 |
| souris conjuguée au PE Isotype IgG1 k | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot : 3046675, RRID : AB_396091 |
| conjuguée au PE isotype IgG2a k | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot : 3035934, RRID : AB_ 395953 |
| souris conjuguée PE isotype IgG2b k | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot : 3098896, RRID : AB_396086 |
| Colorant de viabilité | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Réactif bloquant | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japon | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria ; III Cell Sorter | |
| Logiciel FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Milieu de différenciation adipogénique | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenèse Kit de différenciation A10070-01 | |
| Milieu de différenciation ostéogénique | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenèse Kit de différenciation A10072-01 | |
| Différenciation chondrogénique moyen ; | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit A10071-01 | |
| Formaldéhyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16 % UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | ||
| 198161 Microscope | Keyence, Osaka, Japon | BZ-X700 |
Références
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaed....
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