Aislamiento y caracterización de humanas derivadas de cordón Umbilical las células madre mesenquimales de prematuros y recién nacidos a término
Summary
Cordón umbilical humano (UC) puede obtenerse durante el período perinatal como consecuencia de la prematuro, término y entrega de postterm. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-derivados de células madre mesenquimales (MSCs-UC) de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.
Abstract
Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial terapéutico considerable y atraen creciente interés en el campo biomédico. MSCs son originalmente aislados caracterizados de la médula (BM), y adquirió de tejidos incluyendo el tejido adiposo, membrana sinovial, piel, pulpa dental y apéndices fetales tales como placenta, sangre del cordón umbilical (UCB) y del cordón umbilical (Cu). MSCs son una población heterogénea de células con capacidad para (1) adherencia al plástico en condiciones de cultivo estándar, expresión de marcadores (2) superficie de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenotipos de /HLA-DR– –y (3) diferenciación del trilineage en adipocitos, osteocitos y condrocitos, tan definidos por la sociedad internacional de terapia celular (ISCT). Aunque el BM es la fuente más usada de MSCs, la naturaleza invasiva de aspiración BM éticamente limita su accesibilidad. Capacidad de proliferación y diferenciación de MSCs obtenidos del BM generalmente disminuir con la edad del donante. Por el contrario, MSCs fetales obtenidos de la UC tienen ventajas como la vigorosa proliferación y capacidad de diferenciación. No hay ninguna preocupación ética para el muestreo de la UC, como normalmente se considera como desechos médicos. UC humano comienza a desarrollarse con un continuo crecimiento de la cavidad amniótica en 4-8 semanas de gestación y sigue creciendo hasta llegar a 50-60 cm de longitud, y puede ser aislado durante el período de entrega de todo recién nacido. Para ganar la penetración en la patofisiología de enfermedades intratables, hemos utilizado deriva de UC MSCs (UC-MSCs) de los niños entregados diferentes edades gestacionales. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-MSCs de fetos/recién nacidos 19-40 semanas de gestación.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSCs) son originalmente aisladas y caracterizado de la médula (BM)1,2 pero también puede obtenerse una gran variedad de tejidos incluyendo el tejido adiposo, membrana sinovial, piel, pulpa dental y apéndices fetales 3. MSCs son reconocidos como una población heterogénea de células que puede proliferar y diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos. Además, MSCs poseen la capacidad de migrar a sitios de lesión, inhiben y modulan la respuesta inmune y remodelar y reparar lesiones. En la actualidad, MSCs de diferentes fuentes han atraído un interés creciente como fuente para terapia celular contra un número de enfermedades intratables, como injerto – versus – host disease, infarto de miocardio, infarto cerebral4,5 .
Aunque el BM es la fuente más bien caracterizada de MSCs, la invasividad de la aspiración de BM éticamente limita su accesibilidad. Capacidad de proliferación y diferenciación de MSCs obtenidos del BM generalmente disminuir con la edad del donante. En cambio, MSCs fetales obtienen de apéndices fetales tales como placenta, sangre del cordón umbilical (UCB), y del cordón umbilical (Cu) tienen ventajas como menos éticos preocupaciones con respecto a la toma de muestras y robusta la proliferación y diferenciación capacidad6 , 7. entre los apéndices fetales que normalmente se desechan como residuos, UCB y UC se consideran un órgano fetal, mientras que la placenta se considera del fetomaternal. Además, placenta y UCB deben ser muestreados y recogidos en el momento exacto de la entrega del recién nacido, mientras que la placenta y UC pueden ser recogido y procesado después de la entrega del recién nacido. Por consiguiente, la UC es una fuente prometedora de MSC para celular terapia8,9.
UC humano comienza a desarrollarse con la progresiva expansión de la cavidad amniótica en 4-8 semanas de gestación, crece hasta 50-60 cm de longitud y puede ser aislado durante todo el período de recién nacido entrega10. Para ganar la penetración en la patofisiología de enfermedades intratables, utilizamos derivados del UC MSCs (UC-MSCs) de los niños entregados diferentes edades gestacionales11,12. En este protocolo, describimos cómo aislar y caracterizar MSCs UC de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs pueden aislarse de una variedad de tejidos y son una población heterogénea de células que express no todos los mismos marcadores fenotípicos. Aquí delineamos un protocolo que guía la recolección y disección de la UC de neonatos prematuros y de término y permite el aislamiento y la cultura de la UC-MSCs. Siguiendo este protocolo, hemos aislado con éxito UC-MSCs que cumplan con los criterios ISCT19 de fetos/bebés entregados en 19-40 semanas de gestación y demostrado que representan …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Scientific Research (C) (número: 25461644) y jóvenes científicos (B) (concesión de números: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
