Isolering och karakterisering av navelsträngen-derived mesenkymala stamceller från prematura och benämner spädbarn
Summary
Mänskliga navelsträngen (UC) kan erhållas under den perinatala perioden till följd av prematura, sikt och postterm leverans. I detta protokoll beskriver vi isolering och karakterisering av UC-derived mesenkymala stamceller (UC-msc) från foster/spädbarn på 19-40: e graviditetsveckan.
Abstract
Mesenkymala stamceller (MSC) har stor terapeutisk potential och locka ökande intresse för det biomedicinska fältet. MSCs är ursprungligen isolerade kännetecknas från benmärg (BM) och förvärvade från vävnader inklusive fettvävnad, synovialvätskan, hud, tandpulpan och fostrets bihang till exempel moderkakan, navelsträngsblod (UCB) och navelsträngen (UC). MSCs är en heterogen cell befolkningen med kapacitet för (1) efterlevnad av plast i standard odlingsbetingelser, (2) ytan markör uttryck för CD73+/CD90+/CD105+/CD45–/CD34–/CD14–/CD19 –/HLA-DR– fenotyper och (3) trilineage differentiering in adipocyter, osteocyter och kondrocyter, som för närvarande definieras av den internationella föreningen för cellulära terapi (ISCT). Även om BM är den vanligaste källan till MSCs, begränsar invasiva arten av BM aspiration etiskt dess tillgänglighet. Proliferation och differentiering kapacitet av MSCs erhållits från BM generellt avtar med åldern av givaren. Däremot har fostrets MSCs erhållits från UC fördelar såsom kraftig proliferation och differentiering kapacitet. Det finns inga etiska oro för UC provtagning, eftersom det betraktas vanligtvis som medicinskt avfall. Mänskliga UC börjar utveckla med fortsatt tillväxt av fostervatten kaviteten på 4-8: e graviditetsveckan och håller växer tills de når 50-60 cm i längd, och det kan vara isolerade under leveransperioden helt nyfödda. För att få inblick i patofysiologin av svårbehandlade sjukdomar, har vi använt UC-derived MSCs (UC-MSCs) från spädbarn levereras vid olika graviditetsdiabetes ålder. I detta protokoll beskriver vi isolering och karakterisering av UC-MSCs från foster/spädbarn på 19-40: e graviditetsveckan.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) är ursprungligen isolerade och kännetecknas från benmärg (BM)1,2 men kan även erhållas från en mängd olika vävnader inklusive fettvävnad, synovialvätskan, hud, tandpulpan och fostrets bihang 3. MSCs redovisas som en heterogen cell population som kan föröka sig och differentiera i adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Dessutom MSCs besitter förmågan att migrera till platser av skada, undertrycka och modulera immunsvaret, och renovera och reparera skadan. För närvarande har MSCs från olika källor lockade växande intresse som en källa för cellterapi mot ett antal svårlösta sjukdomar, inklusive graft – versus – host sjukdom, hjärtinfarkt och cerebral infarkt4,5 .
Även om BM är mest välkarakteriserad källan av MSCs, begränsar invasivitet av BM aspiration etiskt dess tillgänglighet. Proliferation och differentiering kapacitet av MSCs erhållits från BM generellt avtar med åldern av givaren. Däremot fostrets MSCs erhållits från fostrets bihang till exempel moderkakan, navelsträngsblod (UCB), och navelsträngen (UC) har fördelar inklusive mindre etiska betänkligheter angående provtagning och robust proliferation och differentiering kapacitet6 , 7. bland fostrets bihang som vanligen kasseras som medicinskt avfall, UCB och UC betraktas ett fostrets organ, medan moderkakan anses Fetomaternell. Dessutom behöver moderkakan och UCB provtas och samlas in på det exakta ögonblicket nyfödda leverans, medan placenta och UC kan samlas in och bearbetas efter nyfödda leverans. UC är således en lovande MSC källa för cell terapi8,9.
Mänskliga UC börjar utveckla med progressiv utvidgning av fostervatten kaviteten på 4-8: e graviditetsveckan, fortsätter att växa fram till 50-60 cm i längd och kan isoleras under hela perioden av nyfödda leverans10. För att få inblick i patofysiologin av svårbehandlade sjukdomar, använder vi UC-derived MSCs (UC-MSCs) från spädbarn levereras vid olika graviditetslängd åldrarna11,12. I detta protokoll beskriver vi hur man isolera och karakterisera UC-MSCs från foster/spädbarn på 19-40: e graviditetsveckan.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs kan isoleras från en mängd olika vävnader och är heterogen population av celler som gör inte alla express samma fenotypiska markörer. Här, skisserat vi ett protokoll som guidar insamling och dissektion av UC från prematura och fullgångna spädbarn och möjliggör isolering och kultur av UC-MSCs. Efter detta protokoll, har vi framgångsrikt isolerade UC-MSCs som uppfyller ISCT kriterier19 från foster/spädbarn levereras på 19-40: e graviditetsveckan och visat att de representerar vi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Grants-in-Aid för Scientific Research (C) (bevilja nummer: 25461644) och unga forskare (B) (bevilja nummer: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) av JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
