무기 Polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금
Summary
그람 양성, 그람 음성, mycobacterial 종 등 다양 한 박테리아에 무기 polyphosphate의 급속 한 정량화를 위한 간단한 방법을 설명 합니다.
Abstract
무기 polyphosphate (폴립) 셀 생활의 모든 도메인에 있는 생물학 고분자 이며 독성 및 많은 박테리아에 스트레스 반응. 많은 노동 집약 하거나 구분 하지 않습니다, 그들의 유용성을 제한 하는 생물 자료에 측량 용 종에 대 한 방법의 다양 한이 있다. 선물이 여기 박테리아, 부 량 폴립에 대 한 효율적인된 방안을 여러 샘플, 폴립 전용 exopolyphosphatase ScPPX와 폴립의 소화 및 감지의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 사용 하는 결과 민감한 ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과 함께 무료 인산 염. 이 절차 간단, 저렴, 이며 다양 한 세균성 종에 신뢰할 수 있는 폴립 정량화를 수 있습니다. 그램 음성 박테리아 (대장균), 그람 양성 젖 산 박테리아 (유산 균 reuteri), 및 mycobacterial 종 (진 균 smegmatis)에서 대표적인 폴립 정량화 선물이. 우리는 또한 어떤은 현재 상업적으로 사용할 수 밀리 그램 양의 ScPPX, 니켈 친 화력 정화에 대 한 간단한 프로토콜 포함.
Introduction
무기 polyphosphate (폴립)은 인생1,2,3의 모든 도메인에 있는 phosphoanhydride 연결 인산 염 단위의 선형 biopolymer 이다. 다양 한 박테리아에서 폴립 스트레스 반응, 운동 성, biofilm 형성, 세포 주기 제어, 항생제 내성, 및 독성4,,56,7,8이 필수적입니다. ,9,,1011. 박테리아 물질 대사 폴립의 연구는 따라서 질병의 원인이 다양 한 환경에서 번 창 하는 박테리아의 기능에 대 한 근본적인 통찰력을 얻을 수가 있다. 그러나 많은 경우에,, 세균성 세포 측정 폴립에 대 한 사용할 수 있는 방법 이러한 연구에 제한 요인이 있습니다.
현재 생물학 물자에서 폴립 수준을 측정 하는 데 사용 하는 여러 방법이 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 두 가지 단계를 포함: 폴립을 추출 하 고는 폴립 측정 그 추출 물에 존재. Bru와 동료12, DNA 및 RNA 페 놀을 사용 하 여 추출 폴립 효 모 Saccharomyces cerevisiae 에 대 한 개발 현재 골드 표준 방법 및 클로 프롬, 에탄올 강수량, 치료 뒤 deoxyribonuclease (DNase) 및 ribonuclease (RNase), 그리고는 S. cerevisiae 폴립 저하 효소 exopolyphosphatase (ScPPX)13 를 사용 하 여 계량 다음은 자유로운 인산 염, 결과 순화 된 폴립의 소화는 말라 카이트 그린 기반 색도계 분석 결과입니다. 이 절차는 매우 양적 하지만 단일 실험에서 처리할 수 있는 세균성 샘플에 대 한 최적화 되지 않은 샘플의 수를 제한 하는 노동 집약. 다른 다양 한 세포와 실리 카 비즈 (이 하 “glassmilk”) 또는 실리 카 막 열6,14,15,,1617를 사용 하 여 조직에서에서 폴립을 추출 보고 있다 18. 이 방법을 할 효율적으로 추출 하지 짧은 체인 폴립 (60 인산 염 단위)12,,1415, 비록이 일반적으로 생각 되 고 주로 합성 박테리아에 대 한 더 적은 관심 긴 체인 용 종3. 강한 산19,20 를 사용 하 여 폴립 추출의 이전 방법 더 이상 널리 사용 폴립12산 성 조건 안정 되어 있기 때문.
또한 측정 폴립에 대 한 보고 방법의 다양 한이 있다. 가장 일반적인 가운데 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 더 일반적으로 DNA를 얼룩 사용 형광 성 염료 이다. DAPI 폴립 단지 DAPI DNA 단지21,22, 보다 다른 형광 여기 및 방출 맥시 마 하지만 상당한 간섭 RNA, 뉴클레오티드, 이노 시 톨 등 다른 세포질 분 대에서 인산 염12,15,,1623, 특이성 및이 메서드를 사용 하 여 만든 폴립 측정의 감도 감소. 폴립과 아데노신 diphosphate (ADP)를 아데노신 3 인산 염 (ATP) 사용 하 여 순화 된 대장균 으로 변환할 수 또는 폴립 키 (ppk 모델)와 luciferase14,17 사용 하 여 계량 결과 ATP ,18. 이 매우 적은 양의 폴립, 탐지를 허용 하지만 두 효소 반응 단계와 소와 매우 순수한 ADP, 비싼 시 약입니다. ScPPX로 특별히 다이제스트 폴립 무료 인산 염6,12,13,24, 간단 방법, 하지만 ScPPX을 사용 하 여 감지 될 수 있는 DNA와 RNA12, 저해 포함 하는 폴립의 필요로 DNase 및 RNase 처리를 추출합니다. Ppk 모델도 ScPPX 상업적으로 사용할 수 있으며 ppk 권총 정화는 상대적으로 복잡 한25,26.
있으 나 세포 lysates 또는 추출에 폴립 DAPI 부정적인 얼룩27,,2829,30, 체인 길이의 평가 허용지 않습니다 하지만 하는 방법에 의해 polyacrylamide 젤에도 구상 될 수 있다 낮은 처리량 그리고 저조한 양적.
우리는 이제 다양 한 세균성 종의 수준 폴립의 급속 한 정량화를 허용 하는 빠르고, 저렴 한, 중간 처리량 폴립 분석 결과 보고 합니다. 이 메서드는 셀룰러 가수분해, 여러 샘플의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 다음 비활성화를 4m guanidine isothiocyanate (GITC)14 에서 95 ° C에서 세균성 세포를 lysing 여 시작 합니다. 결과 폴립 포함 된 추출 다음 DNase 및 RNase 처리를 위한 필요를 제거 하는 ScPPX의 큰 과잉을 가진 소화 된다. 우리는 ScPPX 밀리 그램 양의 간단 니켈 친 화력 정화에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 마지막으로, 무료 인산 폴립 파생 된 간단 하 고, 민감한, ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과24 정량 이며 총 세포질 단백질에 정규화. 이 메서드 세균성 세포에 폴립의 측정을 간소화 하 고 우리 그람 음성 세균, 그람 양성 세균 및 mycobacteria의 대표 종으로 그것의 사용을 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 간소화 되 고 완전히 처리 약 1.5 h 복용 24 샘플의 전형적인 세트와 함께 다양 한 박테리아에서 폴립 레벨의 정량화를 가속 한다. 이 샘플의 신속한 심사 및 돌연변이 라이브러리의 분석을 허용 하 고 운동 실험 시간이 지남에 폴립의 축적을 측정을 단순화 합니다. 우리는 프로토콜 대표자 3 다른 문의에 효과적으로 작동 증명: proteobacteria firmicutes, 그리고 actinobacteria, 그들의…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 알라바 마의 대학 버밍엄과 미생물학의 시동 자금 및 NIH 부여 R35GM124590 (MJG), 및 NIH 부여 R01AI121364 (FW)에 지원 됩니다.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
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