JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Published: January 21, 2019
doi:
10.3791/58818
, , ,
1Department of Microbiology,University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases,University of Alabama at Birmingham

Summary

İnorganik polifosfat, gram pozitif, gram-negatif ve Mikobakteriyel türler de dahil olmak üzere çeşitli bakterilerde hızlı miktar için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

İnorganik polifosfat (polip) yaşamın tüm etki alanları arasındaki bulundu biyolojik bir polimerdir ve virülans ve stres yanıt olarak birçok bakteri için gereklidir. Sayısal polip Biyolojik materyallerde, emek yoğun ya da duyarsız, kullanışlılığı sınırlama birçoğu için yöntemler vardır. Burada bakteri, polip miktar için akıcı bir yöntem birden çok örnekleri, polip polip özgü exopolyphosphatase ScPPX ile sindirim ve tespiti hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma kullanarak mevcut hassas bir askorbik asit tabanlı kolorimetrik yöntemi ile elde edilen ücretsiz fosfat. Bu yordamı basit, ucuz ve güvenilir polip miktar farklı bakteriyel türler sağlar. Biz temsilcisi polip miktar gram-negatif bakteri (Escherichia coli), gram-pozitif laktik asit bakteri (Lactobacillus reuteri) ve Mikobakteriyel türler (Mycobacterium smegmatis) mevcut. Biz de şu anda ticari olarak kullanılabilir durumda değilse nikel benzeşme arıtma ScPPX, mg miktarlarda için basit bir protokol içerir.

Introduction

İnorganik polifosfat (polip) hayat1,2,3tüm etki alanlarında bulunan doğrusal bir biyopolimer fosfat phosphoanhydride bağlı birimlerin var. Çeşitli bakteri, polip stres tepkisi, hareketliliği, biyofilm oluşumu, hücre döngüsü kontrol, antibiyotik direnci ve virülans4,5,6,7,8 için önemlidir ,9,10,11. Bakteri metabolizmasında polip çalışmaların bu nedenle hastalığa neden ve farklı ortamlarda gelişirler için bakteri yeteneğini temel anlayışlar verim potansiyeline sahip. Birçok durumda, ancak, bu çalışmalarda kısıtlayıcı bir faktör bakteri hücreleri içinde sayısal polip için kullanılabilen yöntemleri vardır.

Şu anda Biyolojik materyallerde polip düzeylerini ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. Bu yöntemler genellikle iki farklı adımları içerir: polip ayıklanması ve polip miktarının mevcut bu özler. Maya Saccharomyces cerevisiae Bru ve meslektaşları12, özleri polip yanı sıra DNA ve RNA fenol kullanarak tarafından geliştirilen geçerli altın standart yöntem ve kloroform, etanol yağış, tedavi ile takip deoksiribonükleaz (DNaz) ve ribonükleaz (RNase) ve sonra kullanarak sayısal ücretsiz fosfat verim S. cerevisiae polip aşağılayıcı enzim exopolyphosphatase (ScPPX)-13 ile elde edilen arıtılmış polip sindirim bir malakit Renkölçer tahlil yeşil tabanlı. Bu yordamı son derece nicel ama emek yoğun, tek bir deneyde işlenebilir ve bakteriyel örnekleri için optimize edilmemiştir örneklerini sayısını sınırlama. Diğerleri polip hücre ve dokuların silis boncuk (“glassmilk”) veya silis membran sütunları6,14,15,16,17kullanarak çeşitli ayıklama bildirdin, 18. Bu bakteriler, genellikle öncelikle sentezlemek için düşünülen için daha az endişe olmasına rağmen bu yöntemleri verimli bir şekilde kısa zincir polip (az 60 fosfat adet)12,14,15, ayıklamak değil uzun zincirli polip3. Polip asidik koşulları12altında kararsız olduğundan polip ekstraksiyon kuvvetli asit19,20 kullanarak eski yöntemler artık yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ayrıca sayısal polip için bildirilen yöntemler vardır. En ‘ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), genellikle DNA leke için kullanılan bir floresan boya daha yaygındır. DAPI-polip kompleksler farklı floresan uyarma ve emisyon maxima DAPI-DNA komplekslerinde21,22daha var ama diğer hücresel bileşenleri, RNA, nükleotit ve inositol de dahil olmak üzere önemli girişim yapmaktadır özgüllük ve polip ölçümleri bu yöntem kullanılarak yapılan duyarlılığını azaltarak fosfatlar12,15,16,23. Alternatif olarak, polip ve adenozin nükleotittir (ADP) adenozin arıtılmış Escherichia coli kullanarak trifosfat (ATP) dönüştürülebilir polip kinaz (PPK) ve luciferase14,17 kullanarak sayısal sonuç ATP ,18. Bu polip çok az miktarda algılanmasını sağlar, ancak iki enzimatik reaksiyon adımları ve hem biyoluminesans hem de çok saf ADP, pahalı reaktifler olan gerektirir. ScPPX, özellikle digests polip ücretsiz fosfat6,12,13,daha basit yöntemleri ama ScPPX kullanarak tespit24, içine DNA ve RNA12tarafından inhibe DNaz ve RNase tedavi gerektiren polip içeren ayıklar. Ne PPK ne de ScPPX ticari olarak mevcut, ve PPK arıtma oldukça karmaşık25,26.

Polip hücre lysates veya özleri de polyacrylamide jeller üzerinde27,28,29,30, zincir uzunluğu değerlendirilmesi izin vermez, ancak bir yöntem boyama negatif DAPI tarafından görüntülenmeyecektir düşük işlem hacmi ve kötü nicel.

Biz şimdi polip hızlı miktar seviyelerinde farklı bakteri türleri sağlar bir hızlı, ucuz, orta-den geçerek polip tahlil raporu. Bu yöntem, 4 M guanidin isothiocyanate (GITC)14 95 ° C’de bakteri hücreleri hücresel fosfatazlar, birden fazla örnekleri hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma ardından devre dışı bırakabilirsiniz için lysing tarafından başlar. Elde edilen polip içeren özü sonra DNaz ve RNase muamele için ihtiyacını ortadan kaldırarak ScPPX, büyük bir fazlalığı ile sindirilir. Biz basit nikel benzeşme arıtma ScPPX miktarda mg için bir iletişim kuralı içerir. Son olarak, ücretsiz fosfat polip kaynaklı basit, hassas, askorbik asit tabanlı Renkölçer tahlil24 ile sayısal ve toplam hücresel protein için normalleştirilmiş. Bu yöntem polip bakteri hücreleri içinde ölçümü akıcılık ve biz kullanımı gram-negatif bakteriler, gram-pozitif bakteri ve mikobakteriler temsilci türleri ile göstermek.

Protocol

1. arındırıcı Maya Exopolyphosphatase (ScPPX) E. coli protein overexpression gerilme BL21(DE3)31 plazmid pScPPX26 Elektroporasyon32 veya kimyasal dönüştürme33tarafından dönüşümü. Lysogeny suyu (LB) bir 2 L unbaffled şişesi ile pScPPX2 içeren BL21(DE3) bir koloni içinde 100 µg mL-1 ampisilin içeren 1 L aşılamak ve gecede 37 ° C’de, 600 bir absorbans için sallayarak…

Representative Results

Protokolü’nün önemli adımlar Şekil 1′ deki Basitleştirilmiş biçimde diyagramını. Bu iletişim kuralıyla Ayagin Gram-negatif bakteriler, vahşi tipi E. coli kullanımını göstermek için MG165539 LB zengin Orta 37 ° C’de (200 devir/dakika) sallayarak ile orta log fazı için yetiştirilen, sonra durulanır ve ek bir 2s için inkübe 4 g L-1 gl…

Discussion

Burada açıklanan protokol basitleştirir ve tipik bir el tam olarak işlemek için yaklaşık 1,5 saat alarak 24 örnekleri ile çeşitli bakteri, polip düzeylerinin miktar hızlandırır. Bu örnekleri hızlı tarama ve analiz mutant kütüphanelerin izin verir ve kinetik deney polip birikimi zamanla ölçüm kolaylaştırır. Protokol etkili üç farklı kültürlenebilen temsilcileri üzerinde çalışıyor göstermiştir: bakteri, firmicutes ve bunlar, onların esnek için kötü üne sahip olan hücre duvarları<…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje Birmingham bölümü Mikrobiyoloji başlangıç fonlar ve NIH hibe R35GM124590 (MJG) ve NIH hibe R01AI121364 (FW) University of Alabama tarafından desteklenmiştir.

Materials

E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
  33. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Tags

Inorganic PolyphosphateBacterial Stress ResponsePolyP ExtractionPolyP QuantificationLactobacillus ReuteriGITC Lysis BufferBradford AssayEthanol PrecipitationSilica MembraneTris-HCl BufferPhosphate Standards
check_url/fr/58818?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image