Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion
Summary
Différenciation musculaire squelettique est un processus très dynamique, qui s’appuie notamment sur positionnement nucléaire. Nous décrivons ici une méthode pour suivre les mouvements des noyaux par imagerie de cellules vivantes pendant la formation de différenciation et de myotubes myoblastes et d’effectuer une caractérisation quantitative de noyaux dynamique en extrayant les informations de suivi automatique.
Abstract
Un positionnement nucléaire au sein de cellules est important pour plusieurs processus cellulaires dans le développement et la régénération. L’exemple plus intrigant de positionnement nucléaire se produit au cours de la différenciation musculaire squelettique. Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées formés par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivés de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation. Bon positionnement nucléaire au sein des fibres musculaires est nécessaire pour la régénération musculaire correcte et la fonction. La procédure uniforme pour évaluer la formation la différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes s’appuie sur les cellules fixes analysés par immunofluorescence, qui fait obstacle à l’étude du comportement de mouvement et de la cellule nucléaire au fil du temps. Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de formation de différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes par imagerie de cellules vivantes. Nous fournissons un logiciel pour un suivi automatisé nucléaire afin d’obtenir une caractérisation quantitative de haut débit de dynamique nucléaire et le comportement de myoblastes (c.-à-d., la trajectoire) au cours de la différenciation et la fusion.
Introduction
Le muscle squelettique est un tissu plus grand dans le corps humain, pour un total de 35-40 % de la masse de corps1. Cellules satellites sont des cellules souches musculaires, caractérisées anatomiquement par leur position (juxtaposée à la membrane plasmique, sous la couche basale des fibres musculaires), qui donnent lieu à la prolifération de myoblastes (progéniteurs myogéniques), qui finit par différencier et intégrer les myofibres existants et/ou fondre à forme nouvelle myofibres2,3,4. Leur découverte et les progrès dans l’étude de leur biologie a conduit à un aperçu significatif de développement musculaire et la régénération.
Protocoles d’isoler et de se différencier de myoblastes en myotubes ont été mis au point il y a de nombreuses années et sont encore largement utilisés pour étudier les muscles squelettiques différenciation5,6,7. Cependant, la plupart de ces méthodes représente les procédures statiques qui reposent sur l’analyse des cellules fixées et, par conséquent, ne permettent pas de scientifiques pour explorer pleinement les processus hautement dynamiques, telles que la fusion des myoblastes et de la maturation de la fibre musculaire. L’exemple le plus frappant est le positionnement nucléaire, qui est étroitement contrôlée, avec des noyaux au départ dans le centre de la fibre musculaire et, ensuite, situé à la périphérie après la fibre musculaire maturation8,9. L’imagerie Live est la technique la plus appropriée pour obtenir de plus amples aperçus de ce phénomène étrange.
Nous décrivons ici une méthode qui permet aux scientifiques d’enregistrer des myoblastes différenciation et myotubes formation en time-lapse microscopie et pour effectuer des analyses quantitatives de la poursuite automatique des noyaux de myoblastes. Cette méthode fournit une caractérisation quantitative de haut débit de comportement dynamique et de myoblastes nucléaire au cours de la différenciation et la fusion. Le protocole est divisé en quatre parties différentes, à savoir (1) la collection des muscles des membres postérieurs des souris, (2) l’isolement des myoblastes primaires qui consiste dans la digestion mécanique et enzymatique, myoblastes (3) la prolifération et la différenciation et (4) vivre d’imagerie pour suivre les noyaux au cours des 16 premières heures de la différenciation des myoblastes.
Dans la procédure suivante, les myoblastes sont isolés de souris H2B-GFP et traités avec 1 µg/mL de doxycycline pour induire l’expression de la GFP-H2B, comme décrit précédemment10. Alternativement, il est possible d’isoler les myoblastes des autres souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente dans le noyau ou à transfecter les cellules isolées de souris de type sauvage à exprimer une protéine fluorescente dans le noyau, tel que décrit par Pimentel et al. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées qui sont formées par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivée de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation2,3, 4. Afin d’évaluer la différenciation des myoblastes, la procédure commune consiste en cultivant des myoblastes au moyen de différenciation et de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’AFM-Telethon e.v. (#21545) et par la subvention de démarrage de Ospedale San Raffaele (OSR) à S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez du moyeu de l’analyse d’Image de l’Institut Pasteur est reconnue pour partager publiquement ses routines MATLAB « Simple Tracker ».
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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