Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion
Summary
Skelettartiger Muskel Differenzierung ist ein sehr dynamischer Prozess, der besonders auf nukleare Positionierung stützt. Hier beschreiben wir eine Methode um Kerne Bewegungen von live Cell Imaging während Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung verfolgen und eine quantitative Charakterisierung der Kerne Dynamik durch Extrahieren von Informationen aus automatisches Tracking durchzuführen.
Abstract
Nukleare Positionierung innerhalb der Zellen ist wichtig für mehrere zelluläre Prozesse in Entwicklung und Erneuerung. Die faszinierendste Beispiel für nukleare Positionierung tritt während der Skelettmuskulatur Differenzierung. Muskelfasern (Myofibers) sind mehrkernigen Zellen gebildet durch die Fusion von Muskel Vorläuferzellen (Myoblasten) abgeleitet von Muskelstammzellen (Satelliten-Zellen), die Proliferation und Differenzierung zu unterziehen. Richtige nukleare Positionierung innerhalb Myofibers ist erforderlich für die ordnungsgemäße Muskelregeneration und Funktion. Des gemeinsamen Verfahrens Myoblast Differenzierung und Myofiber Bildung Bewertung stützt sich auf feste Zellen analysiert durch Immunfluoreszenz, die das Studium der atomaren Bewegung und Zelle Verhalten im Laufe der Zeit behindert. Hier beschreiben wir eine Methode zur Analyse von Myoblast Differenzierung und Myofiber Bildung von live Cell Imaging. Wir bieten eine Software für die automatisierte nuklearen Verfolgung eine Hochdurchsatz-quantitative Charakterisierung der nuklearen Dynamik und Myoblast Verhalten (d. h. die Flugbahn) während der Differenzierung und Fusion zu erhalten.
Introduction
Skelettmuskulatur ist das größte Gewebe im menschlichen Körper, in Höhe von 35 % – 40 % des Körper-Masse-1. Satellitenzellen sind Muskelstammzellen, anatomisch zeichnet sich durch ihre Position (gegenübergestellt, der Plasmamembran, darunter die Basallamina der Muskelfasern), die wuchernden Myoblasten (myogen Vorläuferzellen) hervorrufen, die schließlich unterscheiden und in bestehende Myofibers integrieren bzw. Sicherung in Form neuer Myofibers2,3,4. Ihre Entdeckung und den Fortschritt in der Studie von ihrer Biologie führte zu bedeutende Einblicke in Muskelaufbau und Regeneration.
Protokolle zu isolieren und zu differenzieren Myoblasten in Myotubes wurden vor vielen Jahren entwickelt und sind noch weit verbreitet, Skelettmuskel Differenzierung5,6,7zu studieren. Jedoch sind die meisten dieser Methoden statischen Verfahren, die verlassen Sie sich auf die Analyse von festen Zellen und folglich erlauben keine Wissenschaftler, hochdynamische Prozesse, wie z. B. Myoblast Fusion und Myofiber Reifung zu erforschen. Das markanteste Beispiel ist nuklearen Positionierung, welche streng reguliert, mit Kernen zunächst in der Mitte der Myofiber und, dann, befindet sich an der Peripherie nach Myofiber Reifung8,9. Live Bildgebung ist die am besten geeignete Technik um weitere Einblicke in dieses eigenartige Phänomen zu erhalten.
Hier beschreiben wir eine Methode, die Wissenschaftler Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung von Time-Lapse Mikroskopie aufzuzeichnen und Quantitative Analysen über die automatische Verfolgung der Myoblast Kerne ausführen zu können. Diese Methode bietet eine Hochdurchsatz-quantitative Charakterisierung der nuklearen Dynamik und Myoblast Verhalten während der Differenzierung und Fusion. Das Protokoll vier verschiedene Teile, nämlich (1) die Sammlung von Muskeln aus der Hintergliedmaßen von Mäusen, (2) die Isolierung der primären Myoblasten gliedert sich in die mechanische und enzymatische Verdauung, (3) Myoblast Proliferation und Differenzierung (4) besteht Live-imaging, Kerne innerhalb der ersten 16 h der Myoblast Differenzierung zu verfolgen.
In der folgenden Prozedur Myoblasten von H2B-GFP Mäusen isoliert und mit 1 µg/mL von Doxycyclin induzieren H2B-GFP Ausdruck, wie zuvor beschrieben10behandelt. Alternativ ist es möglich, die Myoblasten aus anderen transgenen Mäusen isolieren, die ein fluoreszierendes Protein im Zellkern ausdrücken oder isolierten von Wildtyp Mäusen ein fluoreszierendes Protein im Zellkern, zum Ausdruck bringen, wie von Pimentel Et al. beschrieben Zellen zu transfizieren. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muskelfasern (Myofibers) sind mehrkernigen Zellen, die gebildet werden, durch die Fusion von Vorstufen Muskelzellen (Myoblasten) abgeleitet von Muskelstammzellen (Satelliten-Zellen), die Proliferation und Differenzierung2,3unterzogen werden, 4. Um Myoblast Differenzierung zu beurteilen, besteht das gemeinsame Verfahren der Myoblasten in Medium zu unterscheiden und Fixierung der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das AFM-Telethon e.v. (#21545) und durch das Ospedale San Raffaele (OSR) Samen Zuschuss an S.Z. (ZAMBRA5X1000) unterstützt. Dr. Jean-Yves Tinevez aus dem Bild-Analyse-Hub des Institut Pasteur ist anerkannt für die gemeinsame Nutzung öffentlich seine “Einfache Tracker” MATLAB-Routinen.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
