Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion

Résumé

Différenciation musculaire squelettique est un processus très dynamique, qui s’appuie notamment sur positionnement nucléaire. Nous décrivons ici une méthode pour suivre les mouvements des noyaux par imagerie de cellules vivantes pendant la formation de différenciation et de myotubes myoblastes et d’effectuer une caractérisation quantitative de noyaux dynamique en extrayant les informations de suivi automatique.

Résumé

Un positionnement nucléaire au sein de cellules est important pour plusieurs processus cellulaires dans le développement et la régénération. L’exemple plus intrigant de positionnement nucléaire se produit au cours de la différenciation musculaire squelettique. Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées formés par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivés de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation. Bon positionnement nucléaire au sein des fibres musculaires est nécessaire pour la régénération musculaire correcte et la fonction. La procédure uniforme pour évaluer la formation la différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes s’appuie sur les cellules fixes analysés par immunofluorescence, qui fait obstacle à l’étude du comportement de mouvement et de la cellule nucléaire au fil du temps. Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de formation de différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes par imagerie de cellules vivantes. Nous fournissons un logiciel pour un suivi automatisé nucléaire afin d’obtenir une caractérisation quantitative de haut débit de dynamique nucléaire et le comportement de myoblastes (c.-à-d., la trajectoire) au cours de la différenciation et la fusion.

Introduction

Le muscle squelettique est un tissu plus grand dans le corps humain, pour un total de 35-40 % de la masse de corps¹. Cellules satellites sont des cellules souches musculaires, caractérisées anatomiquement par leur position (juxtaposée à la membrane plasmique, sous la couche basale des fibres musculaires), qui donnent lieu à la prolifération de myoblastes (progéniteurs myogéniques), qui finit par différencier et intégrer les myofibres existants et/ou fondre à forme nouvelle myofibres^2,3,4. Leur découverte et les progrès dans l’étude de leur biologie a c....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de San Raffaele Institutional Animal Care.

1. la dissection des muscles postérieurs de la souris

1. Stériliser les pinces et ciseaux (à la fois droites et courbes) à l’autoclave.
2. Préparer et filtrer (0,22 µm) tous les médias (blocage moyen, moyen de digestion, prolifèrent moyen et moyen de différencier) avant de commencer l’expérience (voir Table des matières).
3. Mettre 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de pétri pour collection de muscle de 35 mm.
4. Sacrifi....

Résultats

Pour suivre automatiquement les mouvement nucléaire au cours de la différenciation des myoblastes en imagerie live, les noyaux doivent préférentiellement être fluorescent étiquetés. Il est important de noter que l’à l’aide de molécules d’ADN-intercalation n’est pas possible car ces molécules interfèrent avec la prolifération et la différenciation des myoblastes primaires¹³. À titre d’exemple, la prolifération et la différenciation ont été analysés dans les myoblast.......

Discussion

Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées qui sont formées par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivée de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation^{2,3, 4}. Afin d’évaluer la différenciation des myoblastes, la procédure commune consiste en cultivant des myoblastes au moyen de différenciation et de fixer les cel.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
extrait d’embryons de poulet	Seralab	CE-650-J
collagénase	Sigma	C9263-1G	125unités/mg
de collagène de peau de veau	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1,78 unités/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
sérum fœtal bovin	Life technologies	10270106
gentamicine	Sigma	G1397
Sérum de cheval	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
pénicilline-streptomycine	Sigma	P0781
globules rouges milieu de lyse	Biolegend	420301
Milieu de digestion
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtré 0,22 um
milieu bloquant
DMEM
Sérum fœtal bovin	10 %
L-glutammine	1 %
pénicilline-streptomycine	1 %
gentamicine	1 et permil ;
filtré 0,22um
milieu de prolifération
IMDM
Sérum fœtal bovin	20 %
L-glutammine	1 %
pénicilline-streptomycine	1 %
gentamicine	1 et permil ;
Extrait d’embryon de chichen	3 %
filtré 0,22um
Medium de différenciation
IMDM
Sérum de cheval	2 %
L-glutammine	1 %
pénicilline-streptomycine	1 %
gentamicine	1 & permil ;
Extrait d’embryon de Chichen	1 %
Filtré 0.22um