Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Summary

Présenté ici est un protocole qui combine un système de co-culture neural-endothelial in vitro et l’incorporation métabolique du sialoglycan avec des groupes fonctionnels bioorthogonals pour étendre les cellules neurales primaires de tige et d’ancêtre et étiqueter leur surface sialoglycoproteins pour l’imagerie ou l’analyse de la spectrométrie de masse des marqueurs de surface cellulaire.

Abstract

Les cellules de tige et d’ancêtre neural (NSPc) sont la base cellulaire pour les structures et les fonctions complexes du cerveau. Ils sont situés dans des niches spécialisées in vivo et peuvent être isolés et étendus in vitro,servant de ressource importante pour la transplantation cellulaire pour réparer les lésions cérébrales. Cependant, les NSPC sont hétérogènes et ne sont pas clairement définis au niveau moléculaire ou purifiés en raison d’un manque de marqueurs de surface cellulaire spécifiques. Le protocole présenté, qui a été précédemment rapporté, combine un système de co-culture neural-endothelial avec une méthode métabolique d’étiquetage de glycan pour identifier le sialoglycoproteome de surface des NSPc primaires. Le système de co-culture endothéliale du NSPC permet l’auto-renouvellement et l’expansion des CNS PNS primaires in vitro,générant un nombre suffisant de NSPC. Les Sialoglycanes dans les NSPC cultivés sont étiquetés à l’aide d’un journaliste métabolique de l’acide sialique contre nature avec groupes fonctionnels bioorthogonal. En comparant le sialoglycoproteome des NSPC auto-renouvellements élargis dans une co-culture endothéliale avec la culture neuronale différenciante, nous identifions une liste de protéines membranaires qui sont enrichies dans les NSPC. Dans le détail, le protocole comprend : 1) la mise en place d’une co-culture endothéliale du NSPC et d’une culture différenciante du CNPC; 2) étiquetage avec azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz); et 3) conjugaison de biotine au sialoglycan modifié pour la formation image après fixation de la culture neurale ou de l’extraction de protéine de la culture neurale pour l’analyse de spectrométrie de masse. Ensuite, les candidats marqueurs de surface enrichis par le NSPC sont sélectionnés par analyse comparative des données de spectrométrie de masse provenant à la fois du NSPC élargi et des cultures neuronales différenciées. Ce protocole est très sensible pour identifier les protéines membranaires de faible abondance dans les matériaux de départ, et il peut être appliqué à la découverte de marqueurs dans d’autres systèmes avec des modifications appropriées

Introduction

Les cellules souches neurales sont définies comme une population de cellules multipotentes qui peut se renouveler pour maintenir une piscine de cellules souches et se différencier en neurones et en gliales. Ils sont les principaux types de cellules dans le système nerveux et peuvent offrir un grand potentiel thérapeutique en médecine régénérative par la transplantation cellulaire dans les cerveaux malades et blessés^1,2. Au fur et à mesure que le développement se poursuit, la population de cellules souches neurales devient hétérogène^3,4, et la proportion de cellules souches neurales dans le cerveau diminue progressivement⁵. D’une manière générale, les cellules souches neurales embryonnaires et d’autres cellules progénitrices neurales, appelées cellules souches et progénitrices neurales (NSPC), sont situées dans les zones germinales, la zone ventriculaire et la zone sous-ventriculaire chez la souris⁶. Dans le cerveau embryonnaire, les cellules souches neurales génèrent des neurones directement ou indirectement par l’intermédiaire des cellules progénitrices intermédiaires (CIP), et chez certaines espèces par l’intermédiaire des progéniteurs de zone sous-ventriculaire externe (ORG)^7,8. La signature moléculaire spécifique, la morphologie, l’emplacement dans la niche de cellules souches, et le potentiel de différenciation déterminent tous le rôle de chaque sous-type dans l’organogenèse du cerveau et les applications cliniques⁹. Cependant, les marqueurs de surface cellulaire actuellement disponibles ne peuvent pas discriminer et purifier sans équivoque différents sous-types de NSPC, limitant la compréhension et l’utilisation de ces sous-types.

L’identification des marqueurs de surface primaires des NSPC est limitée par trois obstacles majeurs. Le premier est le nombre limité de cellules de NSPcC dans le tissu, ce qui rend difficile la préparation d’échantillons de protéines de surface cellulaire pour l’analyse de spectrométrie de masse commune. La deuxième limitation est la difficulté à produire des sous-types de cellules pures pour générer des données de protéines membranaires spécifiques au sous-type. Enfin, le troisième défi est le faible rapport des protéines de surface cellulaire dans les protéines cellulaires entières, ce qui entrave leur sensibilité de détection par l’analyse de spectrométrie de masse.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé une approche chimioprotéomique pour enrichir sélectivement et identifier les protéines de surface cellulaire dans les NSPC primaires en étiquetant métaboliquement les sialoglycoprotéines¹⁰. Pour générer un nombre suffisant de NSPC, nous avons profité d’un protocole établi pour étendre et maintenir les NSPC embryonnaires primaires dans des états indifférenciés in vitro, en co-ccultant des NSPc avec des lignées de cellules endothéliales de cerveau de souris utilisant un support perméable insert de matrice(par exemple, transwell) système¹¹. En revanche, les NPSC cultivés seuls sans cellules endothéliales génèrent la progéniture différenciée^11,12. Ainsi, les échantillons de protéines de ces deux systèmes de culture peuvent être analysés comparativement pour identifier les protéines qui sont exprimées différemment dans les NSPC et les neurones différenciés. Comme la plupart des protéines de surface cellulaire sont modifiées par l’acide sialique¹³, précurseur sialique contre nature précurseur analogique N-azidoacetylmannosamine-tétraacylated (Ac₄ManNAz) a été utilisé pour détourner la voie métabolique intrinsèque de sorte que endogène, nouvellement les sialoglycas synthétisés sont étiquetés avec des groupes d’azido, générant une poignée chimique¹⁴. Grâce à des réactions bioorthogonal salkyne-négociées par azido, qui conjuguent la biotine aux sialoglycans, les protéines de surface cellulaire peuvent être visualisées et enrichies pour l’identification protéomique par un fluorophore couplé à la streptavidine ou une matrice^14.

Ici, nous effectuons la coloration de l’analyse de gel SDS-PAGE du sialoglycoproteome de surface des NSPC étendus dans une co-culture endothéliale et des cellules différenciantes dans un système de non-co-culture. Nous purifions également sélectivement le sialoglycoproteome de surface dans les deux systèmes de culture pour la comparaison protéomique. Notre protocole, comparé aux protocoles traditionnels de purification de surface cellulaire basé sur la centrifugation¹⁵, augmente l’efficacité d’extraction en réduisant les procédures d’extraction de protéine de surface par la conjugaison et l’affinité spécifiques d’étiquette purification. Pendant ce temps, il augmente la pureté d’extraction des protéines de surface cellulaire basée sur la prémisse que la sialylation se produit principalement aux protéines de surface cellulaire. Bien que les facteurs endothéliaux ne puissent pas bloquer complètement la différenciation des NSPC élargis, l’étude comparative entre une co-culture et une culture différenciée fournit une méthode pratique pour identifier les protéines de surface enrichies en cellules souches sans avoir besoin de analyser les protéines des PNJ purifiées par FACS¹⁶. Nous croyons que cette approche peut être appliquée aux études des protéines de surface dans d’autres systèmes avec les modifications appropriées.

Protocol

Tous les protocoles animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par l’IACUC (Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux) de l’Université de Tsinghua et exécutés conformément aux lignes directrices de l’IACUC. L’établissement d’animaux de laboratoire de l’Université de Tsinghua a été accrédité par l’AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Pour la mise en scène des embryons, la mi-journée du bouchon vaginal identifié a été …

Representative Results

L’ensemble de la procédure d’expansion in vitro et d’étiquetage métabolique des NSPC embryonnaires primaires prend 6 jours (figure 1A). La qualité de la lignée cellulaire BEND3 et des NSPC primaires fraîchement isolés est la clé d’une expérience réussie. Les cellules BEND3 sont la source de facteurs solubles qui stimulent l’auto-renouvellement et la prolifération des NSPC. Il faut s’assurer que les cellules BEND3 sont exemptes de toute contaminatio…

Discussion

Les marqueurs de surface sont couramment utilisés pour étiqueter et purifier des types de cellules spécifiques in vitro et in vivo^17,18. La découverte de marqueurs de surface contribue grandement aux recherches sur la médecine régénérative et les cellules souches en fournissant des outils moléculaires pour enrichir sélectivement une population de cellules souches à partir de tissus normaux ou pathologiques et de plats de culture, offrant une cellule pu…

Materials

BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2X	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
urea	Sigma	U5378