Определение клеточных поверхностных маркеров первичных нейронных стволовых и клеток-прародителей путем метаболической маркировки сиалогликан
Summary
Представлен протокол, который сочетает в себе в пробирке нейроэндотелиальной системы ко-культуры и метаболического включения силогликан с биоортогональных функциональных групп для расширения первичных нейронных стволовых и прародителей клеток и этикетки их поверхности sialoglycoproteins для визуализации или масс-спектрометрии анализа маркеров поверхности клеток.
Abstract
Нейронные стволовые и клетки-прародители (NSPCs) являются клеточной основой для сложных структур и функций мозга. Они расположены в специализированных нишах in vivo и могут быть изолированы и расширены in vitro,служа важным ресурсом для трансплантации клеток для восстановления повреждения мозга. Тем не менее, NSPCs являются неоднородными и не четко определены на молекулярном уровне или очищены из-за отсутствия конкретных маркеров поверхности клеток. Представленный протокол, о котором сообщалось ранее, сочетает в себе нейроэндотелиальную систему кокультуры с метаболическим методом маркировки гликанов для идентификации поверхности сиологликопротеом первичных NSPCs. Система сокультуры NSPC-эндотелиальной позволяет самообновлять и расширять первичные NSPCs in vitro,генерируя достаточное количество NSPCs. Sialoglycans в культурных NSPCs помечены с помощью неестественной сиалевой кислоты метаболического репортера с биоортогоналальных функциональных групп. Сравнивая сиалогликопеом из самообновляющихся NSPCs, расширенный в эндотелиальной кокультуры с дифференциацией нейронной культуры, мы определяем список мембранных белков, которые обогащаются в NSPCs. Протокол подробно включает в себя: 1) создание андотелиальной культуры НСПК и дифференциационную культуру НСПК; 2) маркировка с азидосахаром за О-ацетиляцию N-азидоацетилманносамина (Ac4ManNAz); и 3) спряжение биотина с модифицированным сиалогликаном для визуализации после фиксации нейронной культуры или извлечения белка из нервной культуры для анализа масс-спектрометрии. Затем кандидаты на обогащенные поверхностью кандидаты, обогащенные NSPC, отбираются путем сравнительного анализа данных масс-спектрометрии как из расширенных NSPC, так и из дифференцированных нейронных культур. Этот протокол очень чувствителен для определения мембранных белков низкого изобилия в исходных материалах, и он может быть применен к обнаружению маркеров в других системах с соответствующими модификациями
Introduction
Нейронные стволовые клетки определяются как многопотентная популяция клеток, которые могут самообновляться для поддержания пула стволовых клеток и дифференцироваться в нейроны и глию. Они являются основными типами клеток в нервной системе и может предложить большой терапевтический потенциал в регенеративной медицине через пересадку клеток в больные и поврежденные мозги1,2. По мере развития популяция нервных стволовых клеток становится неоднородной3,4,а доля нервных стволовых клеток в головном мозге постепенно уменьшаетсяна 5. Вообще говоря, эмбриональные нервные стволовые клетки и другие нервные клетки-прародители, коллективно называемые нервными стволовыми и клетками-потоменками (NSPCs), расположены в зародышевых зонах, желудочковой зоне и субвентрикулярной зоне у мышей6. В эмбриональном мозге нервные стволовые клетки генерируют нейроны прямо или косвенно через промежуточные клетки-прародители (ИПК), а у некоторых видов через внешние субжелудочковые зоны прародителей (ОРГ)7,8. Специфическая молекулярная подпись, морфология, расположение в нише стволовых клеток и потенциал дифференциации определяют роль каждого подтипа в органогенезе мозга и клинических приложениях9. Однако имеющиеся в настоящее время маркеры поверхности клеток не могут однозначно дискриминировать и очищать различные подтипы NSPCs, ограничивая понимание и использование этих подтипов.
Идентификация первичных поверхностных маркеров NSPCs ограничена тремя основными препятствиями. Первый из них является ограниченное количество клеток NSPCs в ткани, что затрудняет подготовку образцов клеточного белка поверхности для общего анализа масс-спектрометрии. Вторым ограничением является трудность в производстве чистых подтипов клеток для генерации подтип-специфических данных мембранного белка. Наконец, третьей проблемой является низкое соотношение белков поверхности клеток в целых белках клеток, что затрудняет их чувствительность обнаружения с помощью анализа масс-спектрометрии.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали химиопротеомный подход к выборочноо обогащать и идентифицировать белки поверхности клеток в первичных NSPCs путем метаболически маркировки sialoglycoproteins10. Для создания достаточного количества NSPCs, мы воспользовались установленным протоколом для расширения и поддержания первичных эмбриональных NSPCs в недифференцированных состояниях in vitro, путем совместного культивирования NSPCs с мышью мозга эндотелиальных клеточных линий с использованием проницаемой поддержки матричная вставка(например, трансвелл) система11. В отличие от этого, NPSCs культивируется в одиночку без эндотелиальных клеток генерировать дифференцированное потомство11,12. Таким образом, образцы белков из этих двух систем культуры могут быть сравнительно проанализированы для выявления белков, которые дифференцированно выражены в NSPCs и дифференцированных нейронов. Поскольку большинство белков поверхности клеток модифицируются сиалевой кислотой13, неестественный сиалевой кислоты предшественник аналог N-азидоацетилманнозамин-тетраацилат (Ac4ManNAz) был использован для захвата внутренней метаболической пути так, что эндогенные, вновь синтезированные sialoglycans помечены группами азидо, генерации химической ручкой14. Через азидо-алкино-опосредованные биоортогональные реакции, которые спрягают биотин с силогликанами, белки поверхности клеток могут быть визуализированы и обогащены для протеомальной идентификации с помощью стрептавидидного фторофора или матрицы14.
Здесь мы выполняем анализ геля SDS-PAGE поверхности сиологликопротеома из NSPCs, расширенного в эндотелиальной кокультуры и дифференциирующих ячеек в не-кокультурной системе. Мы также избирательно очищаем поверхность силогликопеома в двух культурных системах для протеомического сравнения. Наш протокол, по сравнению с традиционными центрифугина на основе протоколов очистки поверхности клеток15, повышает эффективность экстракции за счет сокращения процедур экстракции поверхностного белка через конкретные спряжения тегов и сродство Очистки. Между тем, это увеличивает чистоту извлечения белков поверхности клеток на основе предпосылки, что сиилиляция происходит в основном на поверхности клеток белков. Хотя эндотелиальные факторы не могут полностью блокировать дифференциацию расширенных NSPCs, сравнительное исследование между совместной культурой и дифференцированной культурой обеспечивает удобный метод определения обогащенных стволовыми клетками поверхностных белков без необходимости анализировать белки из NPCs, очищенных FACS16. Мы считаем, что этот подход может быть применен к исследованиям поверхностных белков в других системах с соответствующими изменениями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поверхностные маркеры обычно используются для маркировки и очистки определенных типов клеток in vitro и in vivo17,18. Открытие поверхностных маркеров вносит значительный вклад в регенеративную медицину и исследования стволовых клеток, предоставляя молекулярн?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Рисунок 1B, 1C, 1E и 1F воспроизводятся на Бай и др. . 10 Лет с разрешения Королевского общества химии. Мы благодарим И Хао в лаборатории X. C. для редактирования фигур. Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (No 91753206 до З. С. и Х. К., No 31371093 до З. С., и No 21425204 и 21672013 до X. C.).
Materials
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Sucrose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
| 6-well plate | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
| Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
| 9AzSia | synthesized in lab | ||
| sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
| urea | Sigma | U5378 |
References
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
- Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
- Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
- Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
- Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
- Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
- Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
- Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
- Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
- O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
- Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
- Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
- Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimie. 48, 6571-6584 (2009).
