Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan
Summary
Presentato qui è un protocollo che combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale in vitro e l’incorporazione metabolica di sialoglycan con gruppi funzionali bioortogonali per espandere le cellule staminali primarie e progenitrici ed etichettare la loro superficie sialoglycoproteins per l’imaging o l’analisi della spettrometria di massa dei marcatori di superficie cellulare.
Abstract
Le cellule staminali neurali e progenitrici (NPG) sono la base cellulare per le strutture complesse e le funzioni del cervello. Si trovano in nicchie specializzate in vivo e possono essere isolati ed espansi in vitro,fungendo da risorsa importante per il trapianto di cellule per riparare i danni cerebrali. Tuttavia, gli NSPC sono eterogenei e non chiaramente definiti a livello molecolare o purificati a causa della mancanza di specifici marcatori di superficie cellulare. Il protocollo presentato, precedentemente riportato, combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale con un metodo di etichettatura glicana metabolica per identificare il sialoglycoproteooma superficiale dei NSPC primari. Il sistema di cocoltura nPC-endoteliale consente l’auto-rinnovamento e l’espansione dei NSPC primari in vitro,generando un numero sufficiente di NSPC. gruppi funzionali bioortogonali. Confrontando il sialoglybioteome da NPG auto-rinnovamento espanso in una co-coltura endoteliale con coltura neurale differenziante, identifichiamo un elenco di proteine di membrana che sono arricchite in NPC. Nel dettaglio, il protocollo prevede: 1) l’impostazione di una cocultura NSPC-endoteliale e la cultura differenziante NSPC; 2) etichettatura con azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); e 3) coniugazione di biotina a sialoglycan modificato per l’imaging dopo la fissazione della coltura neurale o l’estrazione di proteine dalla coltura neurale per l’analisi della spettrometria di massa. Quindi, i candidati marcatori di superficie arricchiti nsPC vengono selezionati mediante analisi comparativa dei dati della spettrometria di massa provenienti sia dal NSPC espanso che dalle colture neurali differenziate. Questo protocollo è altamente sensibile per identificare le proteine della membrana di scarsa abbondanza nei materiali di partenza e può essere applicato alla scoperta di marcatori in altri sistemi con modifiche appropriate
Introduction
Le cellule staminali neurali sono definite come una popolazione cellulare multipotente che può auto-rinnovarsi per mantenere una piscina di cellule staminali e differenziarsi in neuroni e glia. Sono i principali tipi di cellule nel sistema nervoso e possono offrire un grande potenziale terapeutico nella medicina rigenerativa attraverso il trapianto di cellule in cervelli malati e feriti1,2. Come lo sviluppo procede, la popolazione di cellule staminali neurali diventa eterogenea3,4, e la proporzione di cellule staminali neurali nel cervello diminuisce gradualmente5. In generale, le cellule staminali neurali embrionali e altre cellule progenitrici neurali, collettivamente chiamate cellule staminali neurali e progenitrici (NPG), si trovano nelle zone germinali, nella zona ventricolare e nella zona subventricolare nei topi6. Nel cervello embrionale, le cellule staminali neurali generano neuroni direttamente o indirettamente attraverso cellule progenitrici intermedie (IPC), e in alcune specie attraverso la zona subventricolare esterna progenitori (oRG)7,8. La firma molecolare specifica, la morfologia, la posizione nella nicchia delle cellule staminali e il potenziale di differenziazione determinano il ruolo di ciascun sottotipo nell’organogenesi cerebrale e nelle applicazioni cliniche9. Tuttavia, i marcatori di superficie cellulare attualmente disponibili non possono inequivocabilmente discriminare e purificare diversi sottotipi di NSPC, limitando la comprensione e l’utilizzo di questi sottotipi.
L’identificazione dei marcatori di superficie primari dei NSPC è limitata da tre ostacoli principali. Il primo è il numero limitato di nSPC nel tessuto, rendendo difficile preparare campioni di proteine della superficie cellulare per l’analisi comune della spettrometria di massa. La seconda limitazione è la difficoltà di produrre sottotipi di cellule pure per la generazione di dati proteici di membrana specifici del sottotipo. Infine, la terza sfida è il basso rapporto delle proteine della superficie cellulare nelle proteine intere cellule, che ostacola la loro sensibilità di rilevamento mediante l’analisi della spettrometria di massa.
Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un approccio chemiopromico per arricchire e identificare selettivamente le proteine della superficie cellulare nelle NSPC primarie etichettando metabolicamente le sialoglycoproteine10. Per generare un numero sufficiente di NSPC, abbiamo approfittato di un protocollo stabilito per espandere e mantenere gli NSPC embrionali primari in stati indifferenziati in vitro, co-culcolando gli NSPC con linee cellulari endoteliali del cervello del topo utilizzando un supporto permeabile matrice di inserimento (ad esempio, transwell) sistema11. Al contrario, i PNG coltivati da soli senza cellule endoteliali generano progenie differenziata11,12. Pertanto, i campioni di proteine di questi due sistemi di coltura possono essere analizzati comparativamente per identificare le proteine che sono espresse in modo differenziale negli NPC e nei neuroni differenziati. Poiché la maggior parte delle proteine della superficie cellulare sono modificate dall’acido silico13, precursore acido silico innaturale analogico N-azidoacetylmannosamine-tetraacilato (Ac4ManNAz) è stato utilizzato per dirottare la via metabolica intrinseca in modo che endogeno, di recente i sialoglycan sitolizzati sono etichettati con gruppi di azido, generando una maniglia chimica14. Attraverso reazioni bioortogonali mediate azido-alkyne, che coniugano biotina ai sialoglycan, le proteine della superficie cellulare possono essere visualizzate e arricchite per l’identificazione proteomica attraverso un fluoroforo o una matrice accoppiata astampata da streptavidinoo matrice 14.
Qui, eseguiamo la colorazione dell’analisi del gel SDS-PAGE della superficie sialoglycoproteome da NSPC espansa in una co-coltura endoteliale e differenziando le cellule in un sistema non co-culturale. Purifichiamo anche selettivamente il sialoglycoproteome superficiale nei due sistemi di coltura per il confronto proteomico. Il nostro protocollo, rispetto ai tradizionali protocolli di purificazione della superficie cellulare basati sulla centrismola15, aumenta l’efficacia dell’estrazione delle proteine superficiali attraverso specifiche coniugazioni e affinità di tag Purificazione. Nel frattempo, aumenta la purezza di estrazione delle proteine della superficie cellulare sulla base della premessa che la verifica avviene principalmente alle proteine della superficie cellulare. Sebbene i fattori endoteliali non possano bloccare completamente la differenziazione degli NSPC espansi, lo studio comparativo tra una co-coltura e una cultura differenziata fornisce un metodo conveniente per individuare le proteine superficiali arricchite con cellule staminali senza la necessità di analizzare le proteine dai PNG purificate dal FACS16. Riteniamo che questo approccio possa essere applicato agli studi sulle proteine di superficie in altri sistemi con le modifiche appropriate.
Protocol
Representative Results
Discussion
I marcatori di superficie sono comunemente utilizzati per etichettare e purificare specifici tipi di cellule in vitro e in vivo17,18. La scoperta dei marcatori di superficie contribuisce notevolmente alla medicina rigenerativa e alle ricerche sulle cellule staminali fornendo strumenti molecolari per arricchire selettivamente una popolazione di cellule staminali da tessuti e piatti di coltura normali o patologici, offrendo una cellula purificata per uso clinico o …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le figure 1B, 1C, 1E e 1F sono riprodotte da Bai et al . 10 del sistema con il permesso della Royal Society of Chemistry. Ringraziamo Yi Hao nel laboratorio di X. C. per l’editing di figure. Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (da no. 91753206 a Q. S. e X. C., dal n. 31371093 al Q. S., e dal n. 21425204 e da 21672013 a X. C.).
Materials
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Sucrose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
| 6-well plate | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
| Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
| 9AzSia | synthesized in lab | ||
| sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
| urea | Sigma | U5378 |
References
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
- Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
- Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
- Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
- Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
- Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
- Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
- Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
- Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
- O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
- Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
- Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
- Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimie. 48, 6571-6584 (2009).
