Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen
Summary
Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.
Abstract
De lever ontgift schadelijke stoffen, scheidt vitale eiwitten, en voert belangrijke metabole activiteiten, dus behoud van leven. Dientengevolge, leverfalen-die kan worden veroorzaakt door chronische alcohol inname, hepatitis, acute vergiftiging, of andere beledigingen-is een ernstige aandoening die kan uitmonden in bloeden, geelzucht, Coma, en uiteindelijk de dood. Echter, benaderingen voor de behandeling van leverfalen, evenals studies van de leverfunctie en ziekte, zijn gedeeltelijk gestoneerd door het ontbreken van een overvloedig aanbod van menselijke levercellen. Hiertoe beschrijft dit protocol de efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in hepatocyten achtige cellen, geleid door een ontwikkelings roadmap waarin wordt beschreven hoe lever lotgevallen worden gespecificeerd in zes opeenvolgende differentiatie stappen. Door het manipuleren van ontwikkelings signalerings trajecten ter bevordering van de lever differentiatie en expliciet onderdrukken van de vorming van ongewenste cel Fates, deze methode genereert efficiënt populaties van menselijke lever Bud voor ouders en hepatocyte-achtige cellen door dagen 6 respectievelijk 18 van de PSC-differentiatie. Dit wordt bereikt door de tijdelijk nauwkeurige controle van ontwikkelings signalerings trajecten, uitgeoefend door kleine moleculen en groeifactoren in een serumvrij kweekmedium. Differentiatie in dit systeem vindt plaats in monolagen en levert hepatocyten achtige cellen die karakteristieke hepatocyte enzymen uitdrukken en de mogelijkheid hebben om een muismodel van chronisch leverfalen te graveren. De mogelijkheid om efficiënt te genereren grote aantallen menselijke levercellen in vitro heeft vertakkingen voor de behandeling van leverfalen, voor drug screening, en voor mechanistische studies van leverziekte.
Introduction
Het doel van dit protocol is om de menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) efficiënt te differentiëren in verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen en hepatocyten-achtige cel2. Toegang tot een klaar aanbod van menselijke lever voorlopercellen en hepatocyte-achtige cel zal versnellen inspanningen om te onderzoeken van de leverfunctie en ziekte en kan nieuwe cellulaire transplantatie therapieën voor leverfalen3,4, 5. Dit is in het verleden een uitdaging gebleken sinds hPSCs (waaronder embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) in alle celtypen van het menselijk lichaam kunnen worden onderscheiden; Bijgevolg was het moeilijk om ze uitsluitend te differentiëren tot een zuivere populatie van een enkel celtype, zoals levercellen6.
Om hPSCs nauwkeurig te differentiëren in levercellen, is het eerst essentieel om niet alleen te begrijpen hoe levercellen worden gespecificeerd, maar ook hoe niet-lever celtypen zich ontwikkelen. Kennis van hoe niet-levercellen zich ontwikkelen is belangrijk om de vorming van niet-lever lijnen tijdens differentiatie logischerwijs te onderdrukken, waardoor hPSCs uitsluitend naar een leverlot2wordt geleidbaar. Ten tweede is het essentieel om de meervoudige ontwikkelingsstappen te afbakenen waarmee hPSCs zich onderscheiden in de richting van een lever lot. Het is bekend dat hpscs opeenvolgend differentiëren in meerdere celtypen die bekend staan als de primitieve streak (APS), definitieve endoderm (de), posterieure foregut (PFG) en lever Bud voorlopercellen (lb) voor het vormen van hepatocyte-achtige cel(HEP). Eerder werk bleek de signalen die lever lot en de signalen die de vorming van alternatieve niet-levercel-typen onderdrukt (met inbegrip van de maag, pancreas, en intestinale voorlopercellen) bij elke ontwikkeling Lineage keuze2, 7 , 8.
Collectief, deze inzichten hebben geleid tot een serum-vrije, monolaag methode om te onderscheiden hpscs naar primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut, lever Bud voor ouders en ten slotte, hepatocyte-achtige cellen2. Over het algemeen omvat de methode het zaaien van hpscs in een monolaag op een geschikte dichtheid, het voorbereiden van zes cocktails van differentiatie media (met groeifactoren en kleine moleculen die verschillende ontwikkelings signalerings trajecten reguleren), en opeenvolgend toevoegen van deze media om differentiatie te induceren in de loop van 18 dagen. Tijdens het proces is geen passage van cellen nodig. Van noot, omdat deze methode expliciet signalen bevat die de vorming van niet-leverceltypen onderdrukken, genereert deze differentiatie benadering1 efficiënter lever voorlopercellen en hepatocyten achtige cel door vergelijking met bestaande differentiatie methoden2,9,10,11,12. Bovendien kan het in deze tekst beschreven protocol de snellere aanmaak van hepatocyten die uiteindelijk hogere niveaus van hepatische transcriptiefactoren en enzymen uitdrukken dan die geproduceerd door andere protocollen9,10 , 11 , 12.
Het hier beschreven protocol heeft bepaalde voordelen ten opzichte van de huidige differentiatie protocollen. Ten eerste omvat het monolaag-differentiatie van hpscs, wat technisch eenvoudiger is in vergelijking met driedimensionale differentiatie methoden, zoals die welke gebaseerd zijn op embryoïde lichamen13. Ten tweede exploiteert deze methode een recente voorschot waarbij definitieve endoderm cellen (een vroege voorloper van levercellen) efficiënt en snel kunnen worden gegenereerd binnen 2 dagen na de hpsc-differentiatie2,7, waardoor de daaropvolgende productie van hepatocyten met verhoogde zuiverheid. Ten derde produceren de hepatocyte-achtige cellen die met deze methode worden geproduceerd, in vergelijkingen naast elkaar , meer albumine en drukken hogere niveaus van hepatische transcriptiefactoren en enzymen uit in vergelijking met hepatocyten geproduceerd in andere methoden10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode maakt het genereren van verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen, en vervolgens hepatocyte-achtige cel, van hPSCs. Het vermogen om verrijkte populaties van menselijke levercellen te genereren is belangrijk voor het praktische gebruik van dergelijke cellen. Eerdere methoden voor het genereren van hepatocyten van hPSCs leverde onzuivere celpopulaties die zowel lever-als niet-levercellen bevatten die, bij transplantatie in knaagdieren, bot en kraakbeen opleverden naast leverweefsel15…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Bing Lim voor discussies en het Stanford Institute for Stem Cell Biology & regeneratieve geneeskunde voor infrastructuur ondersteuning. Dit werk werd gesteund door het California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) en het Stanford-UC Berkeley Siebel stam Cell Institute (to L.T.A. and K.M.L.) en het Stanford Beckman Center voor moleculaire en genetische geneeskunde, evenals de anonieme, Baxter en DiGenova families (naar K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
