인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화
Summary
이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.
Abstract
간은 유해 물질을 해독하고, 중요한 단백질을 분비하며, 주요 대사 활동을 실행하여 생명을 유지합니다. 따라서 만성 알코올 섭취, 간염, 급성 중독 또는 기타 모욕으로 인해 발생할 수 있는 간 부전은 출혈, 황달, 혼수 상태 및 결국 사망에 이르는 심각한 상태입니다. 그러나, 간 기능 및 질병의 연구 뿐만 아니라 간 부전을 치료 하는 접근, 인간의 간 세포의 풍부한 공급의 부족에 의해 부분적으로 stymied 되었습니다. 이를 위해 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간세포와 같은 세포로 효율적으로 분화하는 것을 상세히 설명하며, 6개의 연속적인 분화 단계에 걸쳐 간 운명이 어떻게 지정되는지를 설명하는 개발 로드맵에 의해 안내된다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 운명의 형성을 명시적으로 억제하기 위해 발달 신호 경로를 조작함으로써,이 방법은 효율적으로 일 6에 의해 인간의 간 꽃 봉오리 선조와 간세포 같은 세포의 인구를 생성 PSC 차별화의 18. 이것은 혈청이 없는 배양 매체에 있는 작은 분자 그리고 성장 인자에 의해 발휘된 발달 신호 통로의 시간적으로 정확한 통제를 통해 달성됩니다. 이 시스템의 분화는 단층에서 발생하고 특징적인 간세포 효소를 발현하고 만성 간 기능 부전의 마우스 모델을 생착시키는 능력을 가진 간세포와 같은 세포를 산출합니다. 효율적으로 생체 외에서 인간의 간 세포의 큰 숫자를 생성 하는 능력은 간 부전의 치료에 대 한 파급 효과, 약물 검사에 대 한, 그리고 간 질환의 기계론 연구에 대 한.
Introduction
이 프로토콜의 목적은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간 싹 선조 및 간세포 유사 세포의 농축된 집단으로 효율적으로 분화하는 것입니다 2. 인간의 간 전구체와 간세포 같은 세포의 준비 공급에 대한 액세스는 간 기능 과 질병을 조사하기위한 노력을 가속화하고 간부전을위한 새로운 세포 이식 치료를 가능하게 할 수 3,4, 5. 이것은 hPSCs (배아 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하는)가 인체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있기 때문에 과거에 도전적인 것으로 입증되었습니다. 결과적으로, 간세포6과같은 단일 세포형의 순수한 집단으로 이들을 독점적으로 분화하는 것이 어려웠다.
hPSCs를 간 세포로 정확하게 분화하려면 먼저 간 세포가 지정되는 방법뿐만 아니라 비 간 세포 유형이 어떻게 발달하는지 이해하는 것이 중요합니다. 비간 세포가 어떻게 발달하는지에 대한 지식은 분화 동안 비 간 혈통의 형성을 논리적으로 억제하는 것이중요하며, 따라서 독점적으로 간 운명을 향한 hPSCs를 유도2. 둘째, hPSC가 간 운명을 향해 차별화되는 다중 발달 단계를 묘사하는 것이 필수적입니다. hPSC는 간세포 유사 세포(HEP)를 형성하기 전에 원시적 줄무늬(APS), 최종 내배엽(DE), 후방 포구트(PFG) 및 간 꽃봉오리 전구(LB)로 알려진 여러 세포 유형으로 순차적으로 분화하는 것으로 알려져 있습니다. 이전 작품은 각 발달 혈통 선택 2에서 간 운명을 지정하는 신호와 대체 비 간 세포 유형 (위, 췌장 및 장 전구체 포함)의 형성을 억제한 신호를 밝혀냈습니다2. 7명 , 8.
전체적으로, 이러한 통찰력은 원시적 인 줄무늬, 최종 내배엽, 후방 포레트, 간 싹 선조 및 마지막으로, 간 세포형 세포2를 향해 hPSCs를분화하는 무혈청, 단층 방법을 초래하였다. 전반적으로 방법은 적절한 밀도에서 단층에서 hPSCs의 시드를 포함, 분화 매체의 여섯 칵테일을 준비 (다양한 발달 신호 경로를 조절 성장 인자와 작은 분자를 포함), 순차적으로 이들 매체를 첨가하여 18일의 과정을 통해 분화를 유도한다. 이 과정에서 세포를 통과하지 못했습니다. 참고로, 이 방법은 비간 세포 유형의 형성을 억제하는 신호를 명시적으로 포함하기 때문에, 이 분화 접근법1은 현존하는 세포에 비해 간 전구체및 간세포 유사 세포를 보다 효율적으로 생성합니다. 차별화 방법2,9,10,11,12. 더욱이, 이 본문에 기술된 프로토콜은 궁극적으로 다른 프로토콜 9,10에 의해 생성된 것보다 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현하는 간세포의 빠른 생성을 가능하게한다. , 11세 , 12.
여기에 설명된 프로토콜은 현재 의분화 프로토콜에 비해 특정 한 장점이 있습니다. 첫째, hPSCs의 단층 분화는 배아체(13)에 의존하는 것과 같은 3차원 분화 방법에 비해 기술적으로더 간단하다. 둘째, 이 방법은 최근 진행된 사전을 통해 최종 내배엽 세포(간 세포의 초기 전구체)가 hPSC 분화2,7일이내에 효율적이고 빠르게 생성될 수 있어 후속 세포가 가능하도록 한다. 순도가 증가한 간세포 의 생산. 셋째, 나란히 비교에서, 이 방법에 의해 생성된 간세포형 세포2는 다른 방법에서 생성된 간세포에 비해 더 많은 ALBUMIN을 생성하고 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현한다10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 hPSCs에서 간 꽃 봉오리 선조, 그리고 이후에 간세포 와 같은 세포의 농축 된 집단의 생성을 가능하게합니다. 인간 간 세포의 풍부한 인구를 생성 하는 능력은 이러한 세포의 실제적인 활용에 대 한 중요 하다. hPSCs로부터 간세포를 생성하는 이전 방법은 설치류로 이식시, 간 조직15이외에 뼈와 연골을 산출하는 간 및 비간 세포를 모두 포함하는 불순한 세포 집단을 산출?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 토론과 줄기 세포 생물학 & 인프라 지원을위한 재생 의학에 대한 스탠포드 연구소 빙 림 에게 감사드립니다. 이 작품은 재생 의학에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 지원되었다 (DISC2-10679) 스탠포드 – UC 버클리 시벨 줄기 세포 연구소 (L.T.A. 및 K.M.L.에) 분자 및 유전 의학뿐만 아니라 익명에 대한 스탠포드 베크만 센터, 박스터와 디제노바 가족 (K.M.L.에).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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