Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine monolayer, serumfreie Methode zur effizienten Erzeugung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 18 Tagen. Dies beinhaltet sechs Schritte, da hPSCs sequenziell in zwischengeschaltete Zelltypen wie den Primitivstreifen, das definitive Endoderm, das hintere Vorgut und die Leberknospenvorläufer differenzieren, bevor hepatozytenähnliche Zellen gebildet werden.
Abstract
Die Leber entgiftet Schadstoffe, sezerniert lebenswichtige Proteine und führt wichtige Stoffwechselaktivitäten aus und erhält so das Leben. Folglich ist Leberversagen – das durch chronischen Alkoholkonsum, Hepatitis, akute Vergiftung oder andere Beleidigungen verursacht werden kann – eine schwere Erkrankung, die in Blutungen, Gelbsucht, Koma und schließlich in todbringend gipfeln kann. Jedoch, Ansätze zur Behandlung von Leberversagen, sowie Studien über Leberfunktion und Krankheit, wurden teilweise durch das Fehlen einer reichlichen Versorgung mit menschlichen Leberzellen behindert. Zu diesem Zweck beschreibt dieses Protokoll die effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen, geleitet von einer Entwicklungs-Roadmap, die beschreibt, wie das Leberschicksal in sechs aufeinanderfolgenden Differenzierungsschritten spezifiziert wird. Durch die Manipulation von Entwicklungssignalwegen zur Förderung der Leberdifferenzierung und zur expliziten Unterdrückung der Bildung unerwünschter Zellschicksale erzeugt diese Methode effizient Populationen menschlicher Leberknospenvorläufer und Hepatozyten-ähnliche Zellen nach Tagen 6 bzw. 18 der PSC-Differenzierung. Dies wird durch die zeitlich präzise Steuerung von Entwicklungssignalwegen erreicht, die von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren in einem serumfreien Kulturmedium ausgeübt wird. Differenzierung in diesem System tritt in Monolayern auf und liefert Hepatozyten-ähnliche Zellen, die charakteristische Hepatozytenenzyme exprimieren und die Fähigkeit haben, ein Mausmodell des chronischen Leberversagens zu transplantieren. Die Fähigkeit, effizient eine große Anzahl von menschlichen Leberzellen in vitro zu erzeugen hat Auswirkungen für die Behandlung von Leberversagen, für Dask.-Screening, und für mechanistische Studien von Lebererkrankungen.
Introduction
Der Zweck dieses Protokolls ist es, menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) effizient in angereicherte Populationen von Leberknospenvorläufern und Hepatozyten-ähnlichen Zellen2zu differenzieren. Der Zugang zu einer bereiten Versorgung mit menschlichen Lebervorläufern und hepatozytenähnlichen Zellen wird die Bemühungen zur Untersuchung der Leberfunktion und -krankheit beschleunigen und könnte neue zelluläre Transplantationstherapien für Leberversagen ermöglichen3,4, 5. Dies hat sich in der Vergangenheit als herausforderunglich erwiesen, da hPSCs (einschließlich embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen) sich in alle Zelltypen des menschlichen Körpers differenzieren können; Folglich war es schwierig, sie ausschließlich in eine reine Population eines einzelnenZelltyps, wie Leberzellen 6, zu differenzieren.
Um hPSCs in Leberzellen genau zu differenzieren, ist es zunächst wichtig, nicht nur zu verstehen, wie Leberzellen spezifiziert werden, sondern auch, wie sich Nicht-Leberzelltypen entwickeln. Das Wissen darüber, wie sich Nicht-Leberzellen entwickeln, ist wichtig, um die Bildung von nicht-liver-Linien während der Differenzierung logisch zu unterdrücken und damit ausschließlich hPSCs zu einem Leberschicksal zu führen2. Zweitens ist es wichtig, die vielfältigen Entwicklungsschritte zu abgrenzen, durch die sich hPSCs in Richtung eines Leberschicksals differenzieren. Es ist bekannt, dass hPSCs sequenziell in mehrere Zelltypen differenzieren, die als Primitivstreifen (APS), definitives Endoderm (DE), hinteres Vorgut (PFG) und Leberknospenvorläufer (LB) bekannt sind, bevor hepatozytenähnliche Zellen (HEP) gebildet werden. Frühere Arbeiten zeigten die Signale, die das Leberschicksal angeben, und die Signale, die die Bildung von alternativen Nicht-Leber-Zelltypen (einschließlich Magen,Pankreas und Darmvorläufer) bei jeder Entwicklungslinie unterdrückten2, 7 , 8.
Zusammengenommen haben diese Erkenntnisse zu einer serumfreien, monolayerMethode geführt, um hPSCs in Richtung Primitivstreifen, definitives Endoderm, hinteres Vorgut, Leberknospenvorläufer und schließlich Hepatozyten-ähnliche Zellen2zu differenzieren. Insgesamt beinhaltet die Methode die Aussaat von hPSCs in einer Monoschicht mit entsprechender Dichte, die Vorbereitung von sechs Cocktails von Differenzierungsmedien (mit Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, die verschiedene Entwicklungssignalwege regulieren) und diese Medien sequenziell hinzufügen, um eine Differenzierung im Laufe von 18 Tagen zu induzieren. Während des Prozesses ist keine Passierung von Zellen erforderlich. Da diese Methode explizit Signale enthält, die die Bildung von Nicht-Leberzelltypen unterdrücken, erzeugt dieser Differenzierungsansatz1 effizienter Lebervorläufer und Hepatozyten-ähnliche Zellen im Vergleich zu Differenzierungsmethoden2,9,10,11,12. Darüber hinaus ermöglicht das in diesem Text beschriebene Protokoll die schnellere Erzeugung von Hepatozyten, die letztlich höhere Mengen an hepatischen Transkriptionsfaktoren und Enzymen ausdrücken als die anderen Protokolle9,10 , 11 , 12.
Das hier beschriebene Protokoll hat gewisse Vorteile gegenüber aktuellen Differenzierungsprotokollen. Erstens beinhaltet sie eine monoschichtige Differenzierung von hPSCs, was im Vergleich zu dreidimensionalen Differenzierungsmethoden, wie z. B. solchen, die auf embryoiden Körpern beruhen, technisch einfacher ist13. Zweitens nutzt diese Methode einen kürzlichen Fortschritt, bei dem definitive Endodermzellen (ein früher Vorläufer von Leberzellen) innerhalb von 2 Tagen nach hPSC-Differenzierung2,7effizient und schnell erzeugt werden können, um so die Herstellung von Hepatozyten mit erhöhter Reinheit. Drittens produzieren die hepatozytenähnlichen Zellen, die mit dieser Methode2 hergestellt werden, in Nebeneinander-Vergleichen mehr ALBUMIN und drücken höhere Konzentrationen von hepatischen Transkriptionsfaktoren und Enzymen aus als Hepatozyten, die in anderen Methoden hergestellt werden10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von angereicherten Populationen von Leberknospenvorläufern und anschließend hepatozytenähnlichen Zellen aus hPSCs. Die Fähigkeit, angereicherte Populationen menschlicher Leberzellen zu erzeugen, ist wichtig für die praktische Nutzung solcher Zellen. Frühere Methoden zur Erzeugung von Hepatozyten aus hPSCs ergaben unreine Zellpopulationen, die sowohl Leber- als auch Nicht-Leberzellen enthielten, die bei der Transplantation in Nagetiere neben Lebergewebe15</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Bing Lim für die Diskussionen und dem Stanford Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine für die Infrastrukturunterstützung. Diese Arbeit wurde vom California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) und dem Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (zu L.T.A. und K.M.L.) und dem Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine sowie dem Anonymous, Familien Baxter und DiGenova (zu K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
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