Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/59016
Automatic Translation
1,2, 3
1Graduate Institute of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Anatomy, School of Medicine, Kaohsiung Medical University, 3Department of Cell Biology and Anatomy, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Adrenal korteks tarafından salgılanan hormon stres ve hastalıklara karşı hayvanlar için hayati önem taşımaktadır. Burada, adrenal hücreler kültür birincil fare için bir iletişim kuralı mevcut. Adrenal steroidogenesis ve lipit sentezi ilgi reaktif mekanizmalarının araştırılması için iyi bir tüp bebek platform olabilir.

Abstract

Adrenal korteks salgılar hormon stres ve hastalıklara karşı hayvanlar için hayati önem taşımaktadır. Burada açıklanan yordam birincil kültürlü sıçan adrenal hücrelerin ve ilgili fonksiyonel deneyleri (ayirt corticosterone analiz yanı sıra lipit damlacık yüzey proteini boyama) yöntemidir. İçinde vivo bir model, aksine interexperiments adrenal monolayer kültürlerde varyasyonu daha az ve deneysel durumu kontrol etmek kolaydır. Ayrıca, kaynağın Rats'in da daha sığır olanlar gibi diğer hayvanların daha kararlıdır. Aynı zamanda adrenal çalışmalarda kullanılan birçok insan adrenal hücre satır (ncı-H295, ncı-H295R, SW13, vb) vardır. Ancak, bu satırları steroid üretimi hala serum lot numarası, geçiş numarası, mutant/zarar farklı genler, vb içeren birçok faktör tarafından etkilenir. 17α-hidroksilaz eksik dışında birincil fare Adrenokortikal hücre adrenal Fizyoloji için daha iyi ve daha uygun bir yüntem kültürdür. Özet olarak, birincil fare adrenal kültürleri iyi bir tüp bebek platform mekanizmaları böbreküstü bezi sistemi ilgi reaktif araştırmak araştırmacılar için olabilir.

Introduction

Endokrin sistemi fizyolojik faaliyetleri ve homeostasis1düzenleyen sorumludur. Böbreküstü bezleri böbrekler kafatası kutbunda yer alan mineralocorticoids, glukokortikoid ve androjen2,3salgılar önemli endokrin organ biridir. Böbreküstü bezinin iki ayrı parçadan oluşur: korteks ve medulla. Adrenal korteks üç katmandan oluşur: dış glomerulosa, ara fasciculata ve iç reticularis3. Zona glomerulosa aldosteron, sodyum iyon ve su böbrekler3reabsorbing AIDS bir mineralocorticoid orijinal secreting sitedir. Zona fasciculata öncelikle glukokortikoid normal fizyolojik şartlarda3Bazal bir seviyede üretir. Kortikosteroidler rodents ve kortizol insanlarda kan glikoz3düzenleyerek vücudun stres ile başa çıkma yardımcı olan hareket. Bir dereceye kadar onlar inflamatuar yanıt inhibe ve bağışıklık sistemi4,5düzenler. Diğer memeliler, fare ve sıçanların aksine bir işlevsel zona reticularis 17α-hidroksilaz ifade eksikliği nedeniyle böbrek üstü bezi6,7' var mı. Böylece, adrenal fareler ve sıçanlar adrenal C-19 steroidler (kortizol ve adrenalin androjenler) salgılanmasını yoksun bulunmaktadır.

Birincil kültürlü Adrenokortikal hücreler adrenal Fizyoloji8kontrol mekanizmaları araştıran için yararlı olduğu gösterilmiştir. Steroidogenic diğer dokular gibi adrenal her bölge kendi steroid ücretsiz kolesterol9sentezler. Adrenocorticotropic hormon (ACTH) stimülasyon, üzerine ücretsiz kolesterol arıza lipid damlacıkları serbest bırakmak ve böylece, steroid üretim fasciculata ve reticularis10artırır.

Birçok grup Adrenokortikal Karsinom istikrarlı hücre satırlarından kurmaya çalıştılar. Ancak, birkaç endişeleri Adrenokortikal hücre hatları vitro modelleri8olduğu gibi kullanımı sınırlı olabilir. Hücre hatları steroid yanıt pasajlar, serum lot numarası ve serum kalitesi arasında farklı olabilir. Ayrıca, ticari adrenal hücre hatları (Y1 ve SW13) corticosterone, adrenal steroidogenesis8çalışmaya daha zor hale salgılar değil. Düz-se bile bu pazarlara dokulardan bilinmeyen bazı riskler belirsiz sığır ve at adrenal kullanarak ex vivo modelleri iyi bir seçim olabilir. Onlara göre sıçan böbrek üstü bezleri yönetmek daha kolaydır ve nispeten daha istikrarlı ve patojen ücretsiz kaynağıdır. Birlikte ele alındığında, burada mevcut olan yöntemi sıçan adrenal fasciculata hücre corticosterone sentezinde ilgili mekanizması araştırmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kaohsiung Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. deneysel bir işlem

  1. Yetişkin (8-12 haftalık) kadın/erkek SD fareler CO2 ötenazi tarafından kurban.
  2. % 70 etanol uygulamak ve cilt içine emilir ve kağıt mendil ile cildinizi silin sağlar.
  3. Sırtüstü pozisyonda temiz plastik tabakta sıçan koymak.
  4. Orta çizgi, "dış" kavisli Forseps ile cilt kaldırın ve "Y" şekil (subcostal açıyla kalça seviyesinden) oluşturarak bir künt diseksiyon gerçekleştirmek.
    1. Makas % 70 etanol ile durulayın ve sonra aynı zamanda bir "Y" şekil oluşturma kas kesti.
  5. Mide arkasında sol böbreküstü bezi bul.
    Not:     sağ böbrek üstü derinden karaciğer bulunabilir.
    1. Bir çift forseps mide veya karaciğer Asansör ve adrenal başka bir eğri Forseps ile ayırmak için kullanın.
  6. Böbreküstü bezleri steril bir tabak içine koyarak sonra iyi Forseps ile adrenal kapsül dikkatli bir şekilde çıkarın.
  7. Makas hassas çifti ile adrenal biraz küçük parçalar halinde kesip serum-Alerjik Dulbecco bit'ın modifiye kartal orta (DMEM) / F-12 orta.
  8. Üç farklı gözenek ölçekli Pasteur pipets hazırlamak ve adrenal taşlarını collagenase II (~0.5–0.8 mg/mL) ile orta içeren bir 50 mL konik tüp içine Aspire edin için ilk Pasteur damlalıklı kullanın.
    1. Yavaşça doku parçaları 10 x hakkında triturate. Pipets kullanabilir ve tüm parçaları daha küçük olana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın.
      Not: Pasteur pipets farklı gözenek boyutları ateşle Isıtma tarafından oluşturulabilir. İlk damlalıklı özgün boyutu (yaklaşık 1 mm) ikinci bir gözenek boyutu yaklaşık 0.8 mm ve üçüncü Pasteur damlalıklı yaklaşık 0.5 mm. Sindirim sırasında böbrek üstü parçaları daha küçük olacak. Böylece, mekanik yordamın daha tamamlanmış adrenal sindirmek. Su banyosu (37 ° C'de) tüp kuluçkaya ve her 5 dk, salla toplam 4 x.
  9. 20 dk kuluçka sonra serin ve taze orta (sixfold birimi; Örneğin, doku 5 mL + 25 mL serin DMEM/F-12 orta) içeren % 2.5 fetal sığır serum (FBS) ve % 5 at serum enzim etkisi durdurmak için ekleyin.
  10. Santrifüjü vasıl 800 x g 10 dk tarafından hücre topakları toplamak.
  11. Orta hücreleri askıya almak için uygun bir hacmi ekleyin.
    Not: Her bezi yaklaşık 3 ~ x 10 yapabilirsiniz5 ~ 4 x 105 hücreleri.
  12. İstenen plakaları veya yemekleri hücrelerde büyüme orta ile plaka (1:1 [v/v] karışımı F-12 orta, DMEM ve Ham'ın takıma 25 mM HEPES ve % 1 penisilin ve streptomisin) % 95 hava ve % 5 CO2oksijen bir ortamda 37 ° c gece (0 gün).
    Not: Genellikle, biz 24-şey tabak (dört bezleri/plaka) hücrelerde corticosterone tahlil için plaka ve 35 mm yemekleri (yemekler bir bezi/yaklaşık 1-2) için tıklayın: western analiz leke..
  13. Dikkatli bir şekilde hücreleri 2 yıkama x ile serum ücretsiz sıcak DMEM/F-12 orta (gün 1). Yeni büyüme orta yerine.
  14. Hücreleri oksijen ortamında % 95 hava ve % 5 CO2 37 ° C'de 3 güne kadar korumak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan yordamı kullanarak, birincil kültürlü adrenal hücreleri (şekil 1A) faz kontrast mikroskop altında seçkin. Daha fazla veziküller içinde sitoplazma lipid damlacıkları olduğunu doğrulamak için ayirt adipose farklılaşma ile ilgili protein (ADRP) Boyama gün-3 kültürler (şekil 1B) yürütülen. Hücreleri üzerinde cam coverslips yetiştirilmiştir. Hücreler fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkanmış ve % 4 paraformaldehyde ile sabit. Üç kez PBS ile yıkama sonra hücreler bloke edildi ve % 0,1 ile % 5 yağsız süt Triton X-100 permeabilized. Birincil ADRP antikor seyreltilmiş (1) %5 yağsız süt yapıldı ve gecede inkübe. Sonra üç kez PBS yıkama, keçi Anti-tavşan Alexa Fluor 488 ikincil antikorlar ile (1: 100) hücreleri inkübe. Çamaşır adımları tekrar sonra hücreler altın Antifade uzatmak montaj orta ile monte edildi ve floresan mikroskop altında incelenmiş. Ayrıca, fare adrenal hücrelerin hormon üreten yetenek corticosterone tahlil tarafından tespit edilemedi. Sıçan adrenal hücrelerde ACTH stimülasyon olumlu bir denetimi (şekil 1 c) olarak hizmet verebilir. Toplanan medya seyreltilmiş ve corticosterone içeriği için Chen ve ark.11tarafından açıklanan yordamı göre denetlesinler.

Figure 1
Şekil 1: adrenal hücreleri ve corticosterone tepki ACTH tedaviye karakterizasyonu. (A)faz kontrast görüntü gün-3 birincil kültürlü sıçan adrenal hücre. (B) ADRP boyama gösterilir. (C) ACTH ile gün-3 kültürlü sıçan adrenal hücreleri tedavi (1 pM ve 1 nM) 6 h için. Medya toplanmış ve-80 ° C buzdolabında kadar kullanmak depolanan. Corticosterone düzeyleri enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından ölçüldü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Böbreküstü bezleri çevresel adaptasyon3' te önemli bir rol oynar. Hangi tarafından adrenal korteks salgılar hormon düzenleyen ve fizyolojik fonksiyonları ve homeostasis3ayarlayın. İçinde vivo modeli gerçek fizyolojik etkileri vücuttaki yansıtır. Ancak, o hala kararsız etkileri deneylerde neden birçok karmaşık faktörlerden etkilenir. Buna ek olarak, in vitro hücre modeli hayvan modeli için eşsiz kılan avantajları vardır. İlk olarak, çevre koşulu tüp bebek sisteminde kontrol etmek kolaydır. Hormonlar tarafından herhangi bir uyarıcı etkilenme olasılığı vardır. Hayvanlar için sıkıntı olduğundan in vivo deneyler genellikle nonspesifik bir reaksiyon neden. İkinci olarak, maddeler vücutta izlemek kolay değildir ama kültürlü sistemdeki sorumlu vardır. Üçüncü olarak, tüp bebek sistemi olan dağılımından bağımsız her deney arasında azaltır. Adrenokortikal hücre iletişim kuralı burada sunulan, ancak % 10-% 20 FBS12,13,14,15, içeren bir kültür medya korumak için % 5 FBS ve % 2.5 at serum kullanır birçok bilimsel raporları göster adrenal hücrelerinin büyümesini bir hafta için.

Steroidogenesis ücretsiz kolesterol bölünme sitokrom P450 yan zinciri bölünme enzimler tarafından başlatılır. Şekil 1ABgösterildiği gibi adrenal hücreleri çok sayıda sergi ve bunu düşündüren lipid damlacıkları farklı boyutlarda steroid biyosentezi ve/veya lipid Biyoloji Araştırma için iyi bir araçtır (fasciculata hücreleri var önemli ve büyük lipid damlacıkları)1,3. ADRP olarak da bilinen perilipin 2, hangi nötr lipitler lipid damlacıkları16içinde depolanmasını yardımcı olur bir lipid damlacık yüzey proteindir. Adrenokortikal hücrelerin lipid, ADRP (veya diğer lipid damlacık yüzey proteinleri, perilipin gibi) bir miktar sergilenmesi nedeniyle hormon sentezi16test aracıları etkiler olup olmadığını incelemek için kullanılabilir.

Büyüme ve böbreküstü bezlerinin işlevi sıkıca hipotalamik hormon serbest corticotropic ve hipofiz ACTH, nöropeptitler, nörotransmitter ve büyüme faktörleri, vb17tarafından kontrol edilir. Şekil 1 c corticosterone üretim önemli ölçüde ACTH tedavi bir konsantrasyon bağımlı moda tarafından indüklenen ortaya koymaktadır. Ayrıca, 1 de ACTH ve 1 nM corticosterone üretim yaklaşık 30 - teşvik ve 70-fold, anılan sıraya göre. 3. gün kültürlü birincil adrenal hücreleri ACTH stimülasyon15daha iyi bir yanıt sergi kanıtlanmıştır. Bu da neden gün-3 Kültür mevcut çalışmada kullanılan nedenidir. Buna ek olarak, corticosterone ELISA kiti tarafından ölçümü araştırma için basit ve kolay bir araç da. Bu nedenle, birincil kültürlü sıçan adrenal hücreleri sadece adrenal steroidogenesis eğitimi için platform sağlar ancak inflamatuar-hastalıkları ile ilgili soruşturma için de geçerli olabilir.

Mevcut protokolündeki kritik adım adrenal sindirim ve kirlenme kontrolü vardır. Bu nedenle, sindirim zaman, fiziksel emiş gücü ve gözlem doku sindirim düzeyi kontrol hücre hayatta kalmak için çok önemli. Ayrıca, deri kesme ve adrenal yalıtma yöntemi de önemlidir. Her zaman herhangi bir hayvan kürk tarafından önlemek amacıyla % 70 etanol tüm araçları bırakın. Daha fazla hücre elde etmek için emme sıklığı daha az on kat her emme sırasında kontrol edilmesi gerekmektedir. Ayrıca, dokuları durumu için iyi değilse daha fazla adımlar, kuluçka collagenase içeren içinde orta 30 dk uzun olmamalıdır.

Sıçan böbrek üstü bezlerinin küçük olduğundan glomerulosa katman adrenal kapsül peeling sırasında kaybolabilir. Bu kapsülden çıkarma bağ dokusu kapsül ve tüm zona glomerulosa18kaldırılmasına sonuçlandı kanıtlanmıştır. Erkek rats böbreküstü bezlerinin bu dişi rats daha küçüktür. Ayrıca, lipid damlacıkları 11 hafta-yaşlı kadın ya da erkek fareler6' daha büyük görünüyor. Kullanılabilir hücre ile ilgili, dişi rats deneyler için iyi bir seçim olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Bilim Konseyi Tayvan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) ve bir ulusal Cheng-Kung Üniversitesi Hastanesi araştırma bursu (NCKUH-10102045) bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) BioLASCO male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments
Collagenase, type II Sigma C-6885 isolation of adrenal cells
DMEM ThermoFisher 12800-017 powder media for adrenal cells
Ham's F12 ThermoFisher 21700-075 powder media for adrenal cells
HEPES JT.baker 4018 buffer (powder)
NaHCO3 JT.baker 3506-1
Horse serum Hyclone 16050014
Fetal bovine serum SAFC 12103C
Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) Corning 30-002-Cl antibiotics
Curved forceps BRAUN BD343R
Forceps BRAUN BD331R
Scissor BRAUN BC224R cut rat skin and muscle
Delicate scissor BRAUN BC101R cut adrenal glands
Adipose-differentiation related protein Abcam ab108323 antibody for lipid droplet associated protein
Corticosterone ELISA kit cayman 500655 assay for corticosterone synthesis
Inverted light microscopy Leica
Fluorescence microscope Nikon
Triton X-100 JT.baker X198-07 for immunofluorescence staining
Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody ThermoFisher A-11034 for immunofluorescence staining
Anti-ADFP Abcam 108323 for immunofluorescence staining
ProLong Gold antifade mountant ThermoFisher P36935 for immunofluorescence staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
  2. Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
  3. Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
  4. Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
  5. Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
  6. Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
  7. van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
  8. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
  9. Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
  10. Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
  11. Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
  12. Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
  13. Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
  14. O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
  15. Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
  16. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  17. Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
  18. O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).

Tags

Biyoloji sayı: 145 böbreküstü bezi Adrenokortikal hücre steroidogenesis endokrin mineralocorticoid glukokortikoid
Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. C., Huang, B. M. Primary… More

Chen, Y. C., Huang, B. M. Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions. J. Vis. Exp. (145), e59016, doi:10.3791/59016 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter