Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen
Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung des Proteinspiegels während der craniofacialmorphogenese/pathogenese durch Immunfärbung anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben von jungen Mäusen zur Immunfärbung.
Abstract
Die Gewebeimmunostainierung ermöglicht einen hochspezifischen und zuverlässigen Nachweis von Proteinen, die innerhalb eines bestimmten Gewebes von Interesse sind. Hier beschreiben wir ein vollständiges und einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinexpression während der craniofacialmorphogenese/pathogenese anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele. Das Protokoll besteht aus der Aufbereitung und Kryosektion von Geweben, indirekter Immunfluoreszenz, Bildaufnahme und Quantifizierung. Darüber hinaus wird eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben zur Immunfärbung beschrieben, bei der craniofacial Gewebe und lange Knochen als Beispiele verwendet werden. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Bestimmung der Proteinexpression und morphologischen/anatomischen Veränderungen in verschiedenen Geweben während der kraniofazianischen Morphogenese/Pathogenese. Sie gelten auch für andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen. Kenntnisse der Histologie und eine hohe Qualität der Abschnitte sind entscheidend, um wissenschaftliche Schlussfolgerungen aus experimentellen Ergebnissen zu ziehen. Mögliche Einschränkungen dieser Methodik sind unter anderem die Spezifität von Antikörpern und Quantifizierungsschwierigkeiten, die auch hier erörtert werden.
Introduction
Das Gesicht ist ein wichtiger Teil der menschlichen Identität, und besteht aus verschiedenen Arten von Geweben, wie Epithel, Muskel, Knochen, Knorpel, Zahn. Diese Gewebe werden aus allen drei Keimschichten abgeleitet: Ektoderm, Endoderm und Mesoderm1,2. Für die richtige Musterung und Entwicklung von craniofacial Geweben, Zellproliferation, Tod und Differenzierung müssen stark koordiniert und reguliert werden durch spezifische Signalwege, wie Wnt, Fgf, Hh und Bmp Wege3,4 ,5. Defekte in der Proliferation, Überleben oder Differenzierung von Zellen führen zu craniofacial Fehlbildungen, die zu den am häufigsten auftretenden angeborenen Geburtsfehlern gehören. Transgene Mäuse sind nützliche Werkzeuge, um Mechanismen der craniofacial Morphogenese und Pathogenese1,2,3,4,5zu untersuchen. Das Verständnis der Veränderungen der craniofacial Strukturen während der Entwicklung und Pathogenese wird dazu beitragen, die wichtigsten Entwicklungsprinzipien sowie die Mechanismen der craniofacial Mformationen1,2,3 zu klären ,4,5.
Die Färbung ganzer Reit- oder Schnittgewebe mit spezifischen Antikörpern ist eine unschätzbare Technik zur Bestimmung der räumlichen Verteilung von Proteinen von Interesse 6. Formal kann sich die Gewebeimmunfärbung entweder auf die Immunhistochemie (IHC) oder die Immunfluoreszenz (IF) stützen. Im Vergleich zu dem opaken Reaktionsprodukt, das mit einem chromogenen Substrat wie 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) von IHC erzeugt wird, beinhaltet IF die Verwendung von fluoreszierenden Konjugaten, die durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar sind. Daher kann IF positive Zellen deutlich von Hintergrundrauschen unterscheiden und ermöglicht es, Bilder auf einfache Weise durch Software wie ImageJ und Adobe Photoshop7,8zu analysieren und zu verbessern. Der gesamte Mount-Färbungsansatz funktioniert auf kleinen Gewebeblöcken (weniger als 5 mm dick), die dreidimensionale Informationen über die Lage von Proteinen/Antigenen liefern können, ohne dass eine Rekonstruktion aus den Abschnitten9,10 erforderlich ist. . Im Vergleich zu Gewebeabschnitten ist die Immunfärbung ganzer Halterungen jedoch zeitaufwändig und erfordert große Mengen an Antikörperlösungen. Nicht alle Antikörper sind mit dem grundlegenden Gesamtmontageansatz kompatibel. Darüber hinaus führt das unvollständige Eindringen von Antikörpern zu ungleichmäßigen Färbungen oder falsch negativen Färbungen. Hier konzentrieren wir uns auf den Immunfluoreszenznachweis von Proteinen/Antigenen auf geschnittenen Geweben. Bei hartem Gewebe (z.B. Kopf, Zahn, langer Knochen) erschwert die Kalziumablagerung während der Entwicklung/Pathogenese die Entnahme der Probe und wird während der Immunfärbung semmen1,12leicht abspült. Die meisten der derzeit verfügbaren Protokolle entkalken harte Gewebe vor der Einbettung, um das Teilen zu erleichtern, was zeitaufwändig ist und Morphologie und Antigene von Proben zerstören kann, wenn sie unsachgemäß behandelt werden11,12. Um die Probleme zu überwinden, optimierten wir einen Ansatz für das Kryosektionen von hartem Gewebe ohne Entkalkung, was zu einer verbesserten Visualisierung ihrer Morphologie und Verteilung von Signalproteinen führte.
Das hier beschriebene Protokoll wird verwendet, um morphometrische und histologische Veränderungen im craniofaziale Gewebe von Transgenen Von BMP-Mäusen zu bestimmen. Konkret umfasst das Protokoll (1) Ernte und Sezieren von Kopfgeweben, (2) Abschnitt und Immunostainierung von experimentellen Markern (Ki67, pSmad1/5/9) zusammen mit TUNEL-Färbung, (3) Abbildung der Abschnitte mit Fluoreszenzmikroskop und schließlich (4) Analyse und Quantifizierung der Ergebnisse. Das Protokoll zur Vorbereitung und Kryosektion von hartem Gewebe ohne Entkalkung wird ebenfalls beschrieben13. Diese Methoden sind für craniofacial Gewebe optimiert. Sie gelten auch für andere Gewebe aus verschiedenen Altersgruppen von Proben mit entsprechenden Modifikationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung von Mauskopf und nicht verkalkten Knochengeweben und Kryosektionen zur Immunfärbung der Zellproliferation, des Zelltodes und der BMP-Signalmarker. Wir beschreiben auch die Strategie zur Gewinnung quantitativer Daten aus immunfluoreszierenden Bildern. Diese Methoden können auch auf andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen anwendbar sein.
Die Bedingungen für die Gewebevorbereitung variieren je nach Größe und Art des Ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01DE020843 bis Y.M.), der International FOP Association (Y.M.) und einem Stipendium der National Natural Science Foundation of China (31500788 bis J.Y.) unterstützt.
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
