マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色
Summary
ここでは、マウス頭蓋組織を例に免疫染色することにより、頭蓋顔面形態/病因の間のタンパク質レベルを検出し、定量するための詳細なプロトコルを提示する。また、免疫染色のための若いマウスからの非デカル化された硬質組織の調製および凍結切除の方法について説明する。
Abstract
組織免疫染色は、所定の組織内の目的のタンパク質の非常に特異的で信頼性の高い検出を提供します。ここでは、マウス頭蓋組織を例にした頭蓋骨形成/病因の間にタンパク質発現を検出するための完全で簡単なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、組織の調製および凍結切除、間接免疫蛍光、画像取得、および定量化で構成されます。また、免疫染色のための非デカール化硬組織の調製および凍結切除のための方法が記載されており、例として頭蓋顔面組織および長骨を用いる。これらの方法は、頭蓋骨形成/病因の間に様々な組織におけるタンパク質発現および形態学的/解剖学的変化を決定する鍵となる。それらは適切な変更を加える他の組織にも適用可能である。血管学の知識とセクションの高品質は、実験的な結果から科学的な結論を引き出すために重要です。この方法論の潜在的な制限には、抗体の特異性および定量化の困難が含まれるが、これらに限定されない。
Introduction
顔は人間のアイデンティティの重要な部分であり、上皮、筋肉、骨、軟骨、歯など、いくつかの異なるタイプの組織で構成されています。これらの組織は、外胚芽、内皮、中胚芽1、2の3つの胚芽層すべてに由来する。頭蓋組織の適切なパターン化と開発のためには、細胞増殖、死亡および分化は、Wnt、Fgf、HhおよびBmp経路3、4などの特定のシグナル伝達経路によって高度に調整され、調節される必要がある。、5.細胞の増殖、生存または分化の欠陥は、最も頻繁に発生する先天性先天性欠損の一つである頭蓋骨の奇形につながります。トランスジェニックマウスは、頭蓋骨形成および病態1、2、3、4、5のメカニズムを研究するのに有用なツールである。発達と病因の間の頭蓋の構造の変化を理解することは、主要な発達原理と頭蓋顔面奇形のメカニズムを明らかにするのに役立ちます1,2,3 、4、5.
特定の抗体を用いたマウント全体または断面組織の染色は、目的のタンパク質6の空間分布を決定するための非常に貴重な技術である。正式には、組織免疫染色は、免疫組織化学(IHC)または免疫蛍光(IF)のいずれかに依存することができます。IHCによる3,3′-Diaminobenziジン(DAB)などの発色基板で生成された不透明反応生成物と比較して、IFは蛍光顕微鏡で見える蛍光コンジュゲートの使用を含む。したがって、IFは明らかにポジティブな細胞をバックグラウンドノイズから区別し、ImageJやAdobe Photoshop 7、8などのソフトウェアによって画像を定量的に分析し、強化することができる。全体のマウント染色アプローチは、セクション9、10からの再建を必要とせずにタンパク質/抗原の位置に関する3次元情報を提供することができ、組織の小さなブロック(厚さ5ミリメートル未満)で動作します。.しかし、組織切片と比較して、マウント免疫染色全体は時間がかかり、大量の抗体溶液を必要とします。すべての抗体が基本的なマウントアプローチと互換性があるわけではありません。さらに、抗体の不完全な浸透は、不均一な染色または偽陰性染色をもたらす。ここでは、切除組織上のタンパク質/抗原の免疫蛍光検出に焦点を当てます。硬い組織(例えば、頭部、歯、長骨)の場合、発症/病因の間のカルシウム沈着は、サンプルを切除しにくくし、免疫染色治療中に容易にすすいでくるぐる。現在利用可能なプロトコルのほとんどは、セクション化を容易にするために埋め込む前に硬い組織をデカール化し、これは時間がかかり、不適切に扱われた場合、サンプルの形態および抗原を破壊する可能性があります11,12.この問題を克服するために、脱石せずに硬質組織を凍結切除するアプローチを最適化し、その形態の可視化とシグナル伝達タンパク質の分布を改善しました。
ここで説明するプロトコルは、BMPトランスジェニックマウスの頭蓋骨組織における形態学的および組織学的変化を決定するために使用されている。具体的には、プロトコルは、(1)頭部組織の収穫と解剖、(2)実験マーカーの切片および免疫染色(Ki67、pSmad1/5/9)およびTUNEL染色、(3)蛍光顕微鏡を用いた切片のイメージング、および最後に(4)を含む。結果の分析と定量化を行います。デカル化せずに硬質組織を調作および凍結切除するプロトコルも13について説明する。これらの方法は頭蓋顔面組織用に最適化されています。それらはまた適切な修飾が付いているサンプルのさまざまな年齢からの他のティッシュに適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、マウスヘッドと非デカル化された骨組織の調製のための詳細なプロトコルと、細胞増殖、細胞死、およびBMPシグナル伝達マーカーの免疫染色のための凍結切除を提供する。また、免疫蛍光画像から定量的データを得るための戦略についても詳しく述べる。これらの方法は、適切な修飾を有する他の組織にも適用可能である。
組織調製の条件は、組織の大きさ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R01DE020843 to Y.M.)、国際FOP協会(Y.M.)、および中国国立自然科学財団(31500788からJ.Y.)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
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