זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה ישימה מיועד לשימוש עם תא תרבות supernatants לאתר epitopes משטח על שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EV). הוא מנצל immunoprecipitation EV ספציפי באמצעות חרוזים בשילוב עם נוגדנים מזהה אנטיגן פני שטח CD9, CD63, CD81. השיטה ממוטבים לניתוח cytometry במורד הזרם.
Abstract
Cytometry זרימה (FC) היא שיטת הבחירה למדידה כמותית למחצה של סמני אנטיגן פני התא. לאחרונה, נעשה שימוש בטכניקה זו עבור ניתוחים פנוטיפי של שלפוחית חוץ-תאית (EV) כולל exosomes (מסכות) הדם ההיקפיים, נוזלי גוף אחרים. גודל קטן של EV מנדטים שימוש בכלים ייעודיים שיש סף גילוי סביב 50-100 ננומטר. לחלופין, EV יכולות להיות קשורות לטקס. גרגרי שניתן לאתר על ידי מועדון הכדורגל. . גרגרי, מצומדת עם נוגדנים מזהה EV-הקשורים סמני/אשכול של בידול CD63, CD9, CD81 יכול לשמש עבור EV לכידה. Exo מבודד ס מ ניתן לנתח עם או בלי העשרה מראש על-ידי ultracentrifugation. גישה זו מתאימה ניתוחים EV באמצעות מכשירים FC המקובלת. התוצאות שלנו להפגין מתאם ליניארי בין ערכי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מתכוון (MFI) וריכוז EV. שיבוש EV דרך sonication באופן דרמטי ירד MFI, המציין כי השיטה אינו מזהה את קרום פסולת. . מדווחים שיטה מדויקת ואמינה עבור הניתוח של אנטיגנים משטח EV, אשר ניתן ליישם בקלות במעבדה כלשהי.
Introduction
תאים מפרישים חוץ-תאית שלפוחית (EV) בגדלים שונים, כולל שלפוחיות זעירות (MV) ו exosomes (מסכות). האחרון ניתן להבדיל בין MV גם בגודל וגם תא subcellular המקור. MV (200 – 1,000 ננומטר בגודל) משתחררים מתאי האב על ידי ששפך של קרום פלזמה. לעומת זאת, Exo (30-150 ננומטר) שמקורם ממברנות endosomal, משתחררים לחלל חוץ-תאית, כאשר הגופים multivesicular (MVB). להתמזג עם קרום התא1,2.
EV יותר ויותר משמש האבחון סמנים ביולוגיים כמו גם, באופן פוטנציאלי, כלים טיפוליים בתחומים רבים, לרבות אונקולוגיה, נוירולוגיה, קרדיולוגיה, מחלות שריר-שלד3,4,5. הרוב המכריע של מחקרים מתמשכת באמצעות EV כמו סוכני טיפולית לנצל את ניתוקה של שלפוחית מ תאים ממוזגים בינוני (ס מ) של תאים בתרבית במבחנה. גזע mesenchymal (MSCs) מפעילים השפעות מועילות בהקשרים מספר, MSC-derived EV הראו יתרונות במודלים של שריר הלב איסכמיה/פגיעה reperfusion פציעה6 ו במוח פציעה7. MSC-derived EV התערוכה גם המערכת החיסונית פעילויות modulatory, שעלולים להיות מנוצלים לרעה לטיפול הדחייה החיסונית, כפי שמתואר במודל של טיפול-חסיני אש שתל – מול – מארח מחלות8. תאי גזע נוזל מי השפיר (hAFS) להעשיר באופן פעיל ס מ עם MVs, מסכות, heterogeneously מופץ בגודלם (50 – 1,000 ננומטר), אשר לתווך מספר אפקטים ביולוגיים, כגון התפשטות של תאים, אנגיוגנזה, עיכוב של פיברוזיס, ו cardioprotection4. לאחרונה הראו לנו EV, במיוחד מסכות, מופרש על ידי האדם, נגזר הלב ובתאים (Exo-CPC) להקטין לאוטם שריר הלב ב חולדות5,9.
Exo שיתוף ערכה משותפת של חלבונים על פני השטח שלהם, כולל tetraspanins (CD63, CD81, CD9), מתחם מרכזי histocompatibility מחלקה אני (MHC-אני). בנוסף זו ערכה משותפת של חלבונים, Exo מכילים גם חלבונים ספציפיים עבור המשנה EV סוג התא מפיק. Exo סמני צוברות חשיבות עליונה כי הם לשחק תפקיד מכריע בתקשורת הבין-תאית, ובכך ויסות תהליכים ביולוגיים רבים5,10. בשל גודלם הקטן, מציאת דרך קלה כדי לנתח EV באמצעות זרימה קלאסית cytometry (FC) שרידים משימה מאתגרת.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוטה לניתוח EV באמצעות FC, אשר יכול להיות מיושם דגימות מראש מועשר שהושג דרך ultracentrifugation או ישירות ס”מ (איור 1). השיטה משתמשת חרוזים מצופים נוגדן ספציפי המאגד הקנוני Exo-הקשורים משטח epitopes (CD63, CD9, CD81) בלי שוטף נוספים. ניתוחים FC יכול להתבצע באמצעות cytometer המקובלת ללא צורך התאמות לפני מדידות. שיטות אפיון אנטיגנים על חלקיקים קטנים בודדים באמצעות זרימת cytometers תוארו על ידי קבוצות אחרות לגבי יישומים שונים11,12,13. כאן השתמשנו beads מגנטי functionalized ללכידתו של חלקיקים קטנים, מסכות, ואחריו phenotyping החלקיקים שנלכדו על ידי מועדון הכדורגל. אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאפיין את ההרכב antigenic של שלפוחית קטנה שפורסמו על ידי כל סוג התא במבחנה, כאן אנחנו סיפקנו התרבות תאים מסוים התנאים החלים על התרבות של האדם ובתאים הלב (CPC) ואת ביותר הסביבה המתאימה לייצור של EV על ידי תאים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת FC המקובלת נשאר השיטה האנליטית הברור ביותר לאפיון סמני הביע על גבי המשטח של EV. בהקשר זה, בחירת הפרוטוקול המתאים ביותר הוא חיוני כדי לקבל מידע שימושי בשברים חלקיקים בודדים של עניין על ידי הימנעות מגבלות עקב רגישות המכשיר. אנחנו תיאר שיטה באמצעות חלקיקים מגנטיים בשילוב עם נוגדנים מזהה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. נתמכה על ידי מענקי מחקר של הלמוט Horten Stiftung ו Velux Stiftung, ציריך (שווייץ). G.V. נתמך על ידי מענקי מחקר של קרן המדע הלאומית השוויצרית, קרן ססיליה-אוגוסטה, לוגאנו לדנציג SHK Stiftung את הרץ-und Kreislaufkrankheiten (שוויץ)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
