Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo
Summary
El protocolo describe un método reproducible diseñado para uso con sobrenadantes de cultivo celular para detectar epítopos superficiales en pequeñas vesículas extracelulares (EV). Utiliza específica inmunoprecipitación EV usando granos juntados con los anticuerpos que reconocen antígenos de superficie CD9, CD63 y CD81. El método está optimizado para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.
Abstract
Citometría de flujo (FC) es el método de elección para la medición semicuantitativa de marcadores de antígeno de superficie celular. Recientemente, esta técnica se ha utilizado para los análisis fenotípicos de vesículas extracelulares (EV) incluyendo exosomas (Exo) en la sangre periférica y otros fluidos corporales. El pequeño tamaño de EV exige el uso de instrumentos dedicados tienen un umbral de detección alrededor de 50-100 nm. Por otra parte, EV se puede enlazar a microesferas de látex que pueden ser detectado por FC. Microesferas, conjugado con anticuerpos que reconocen EV asociado marcadores/Cluster de diferenciación CD63, CD9 y CD81 se pueden utilizar para la captura de EV. Exo de CM puede ser analizada con o sin enriquecimiento previo por ultracentrifugación. Este enfoque es adecuado para análisis EV usando instrumentos convencionales de FC. Nuestros resultados demuestran una correlación lineal entre los valores de la intensidad media de fluorescencia (IMF) y concentración de EV. Interrumpir EV mediante sonicación dramáticamente había disminuido MFI, indicando que el método no detecta restos de membrana. Divulgamos un método exacto y confiable para el análisis de antígenos de superficie de EV, que pueden aplicarse fácilmente en cualquier laboratorio.
Introduction
Las células secretan vesículas extracelulares (EV) de diferentes tamaños incluyendo microvesículas (MV) y exosomas (Exo). Este último puede distinguirse de MV por tamaño y el compartimento subcelular de origen. MV (200-1.000 nm de tamaño) se liberan de las células madre por desprendimiento de la membrana plasmática. Por el contrario, Exo (30 – 150 nm) originan endosomal membranas y se liberan en el espacio extracelular, cuando los cuerpos multivesicular (MVB) se fusionan con la membrana de la célula1,2.
EV son cada vez más utilizados como biomarcadores diagnóstico así como, potencialmente, herramientas terapéuticas en muchos campos como la oncología, Neurología, cardiología y enfermedades musculoesqueléticas3,4,5. Una gran mayoría de los estudios en curso con EV como agentes terapéuticos explotan el aislamiento de las vesículas de acondicionado celular medio (CM) de las células cultivadas in vitro. Las células madre mesenquimales (MSCs) ejercen efectos beneficiosos en varios contextos, y EV derivados de MSC han demostrado beneficios en modelos de isquemia/reperfusión miocardio lesión6 y cerebro lesión7. Derivados de MSC EV también exhiben actividades moduladores inmunes que pueden ser explotadas para el tratamiento de rechazo inmune, como se demostró en un modelo de terapia-refractario injerto – versus – host disease8. Células madre del líquido amniótico (hAFS) enriquecer activamente CM con MVs y Exo, heterogénea en tamaño (50-1.000 nm), que median varios efectos biológicos, tales como proliferación de células diferenciadas, angiogénesis, inhibición de la fibrosis, y cardioprotección4. Hemos demostrado recientemente que EV y particularmente de Exo, secretada por las células del progenitor de origen cardiaco humano (Exo-CPC) reducen el tamaño del infarto de miocardio en ratas5,9.
Exo de compartir un conjunto común de proteínas en su superficie, incluyendo tetraspaninas (CD63, CD81, CD9) y complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I). Además de este conjunto común de proteínas, Exo contienen también proteínas específicas para el subconjunto de EV del tipo de la célula productora. Marcadores de Exo están ganando importancia primordial porque juegan un papel crucial en la comunicación entre celular, de tal modo regulación de muchos procesos biológicos5,10. Debido a su pequeño tamaño, encontrar una manera fácil de analizar EV usando clásico flujo cytometry (FC) sigue siendo una tarea difícil.
Aquí, presentamos un protocolo simplificado para el análisis de la EV con FC, que se puede aplicar a muestras previamente enriquecidas obtenidas mediante ultracentrifugación o directamente a CM (figura 1). El método utiliza bolas recubiertas con un anticuerpo específico que se une canónica asociada a Exo superficie epitopos (CD63, CD9, CD81) sin lavados adicionales. Análisis de la FC pueden realizarse usando un citómetro convencional sin necesidad de ajustes antes de las mediciones. Métodos para la caracterización de antígenos en las partículas pequeñas individuales con citómetros de flujo han sido descritos por otros grupos con respecto a varias aplicaciones11,12,13. Aquí, utilizamos granos magnéticos funcionalizados para la captura de partículas pequeñas y Exo, seguido por fenotipado de partículas captadas por el FC. Aunque este método puede utilizarse para caracterizar la composición antigénica de pequeñas vesículas por cualquier tipo de célula en vitro, aquí proporcionamos condiciones de cultivo de células específicas que se aplican para el cultivo de células progenitoras cardíacas humanas (CPC) y la más ambiente adecuado para la producción de EV por estas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnica FC convencional sigue siendo el método analítico más sencillo caracterizar marcadores expresados en la superficie de EV. En este sentido, seleccionar el protocolo más apropiado es crucial para obtener información útil sobre fracciones de partículas individuales de interés evitando limitaciones debido a la sensibilidad del instrumento. Hemos descrito un método utilizando partículas magnéticas juntadas con anticuerpos que reconocen Exo y pequeño EV los antígenos superficiales que son convenientes para…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. fue apoyado por becas de investigación de Helmut Horten Stiftung y Velux Stiftung, Zurich (Suiza). G.V. fue apoyado por becas de investigación de la Swiss National Science Foundation, la Fundación Cecilia Augusta, Lugano y el SHK Stiftung für Kreislaufkrankheiten und Herz (Suiza)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
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