フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。
Summary
プロトコルでは、小さな細胞小胞 (EV) の表面の抗原を検出する細胞培養上清を使用のために設計された再現可能な方法について説明します。それは、CD63 と CD81 CD9、表面抗原を認識する抗体が結合したビーズを用いた特定の EV 免疫沈降を利用しています。メソッドは、下流の流れフローサイトメトリー分析に最適です。
Abstract
フローサイトメトリー (FC) は、細胞表面抗原マーカーの半定量的測定の選択の方法です。最近、この手法は、末梢血液や他の体液でエクソソーム (Exo) を含む細胞小胞 (EV) の表現型分析に使用されています。小型 EV の周り検出しきい値を持つ専用機器の使用を義務付けて 50 ~ 100 nm。また、EV は、FC で検出できるラテックス ビーズにバインドできます。マイクロ ビーズ、EV 関連マーカー/CD81、CD9、分化 CD63 のクラスターを認識する抗体の共役を使用ことができます EV キャプチャ用。CM から分離された Exo は、超遠心法による前濃縮の有無を分析できます。このアプローチは、従来の FC の楽器を使用して EV 分析に適しています。EV 濃度の平均蛍光強度 (MFI) 値と相関を示した。超音波処理によって劇的に EV を中断することと、MFI、メソッドが膜破片を検出されませんを示すが減少しました。あらゆる研究室で簡単に実装することができます EV の表面抗原の解析の正確かつ信頼性の高い方法を報告する.
Introduction
細胞は、細胞膜小胞 (EV) 機構の解明 (MV) とエクソソーム (Exo) などを含むさまざまなサイズを分泌します。後者は、サイズと起源の細胞レベル下コンパートメントによって MV から区別することがことができます。MV (サイズ 200-1,000 nm) は細胞膜からの放出に親細胞から解放されます。逆に、Exo (30-150 nm) はエンドソーム膜に属し、多胞体 (MVB) 融合細胞膜1,2と、細胞外の空間に解放されます。
EV は、ますます腫瘍、神経、循環器、筋骨格系疾患3,4,5など多くの分野での治療のツールだけでなく、潜在的に、診断バイオ マーカーとして使用します。治療薬の in vitro 培養細胞の細胞調整培 (CM) からの小胞の分離を悪用する EV を使用して進行中の研究の大半。間葉系幹細胞 (Msc) は、いくつかの文脈で有益な効果を発揮し、MSC から派生した EV は、心筋虚血・再灌流傷害6と脳損傷7のモデルの利点を示しています。MSC から派生した EV も免疫調節活動療法不応接木対ホスト病8のモデルで示されているように、免疫拒絶反応を治療するために悪用される可能性を示します。羊水幹細胞 (hAFS) 積極的に豊かに MVs と Exo、異質のサイズ (50-1,000 nm)、分散増殖分化した細胞、血管、線維化の抑制など、いくつかの生物学的効果を媒介する CM、心臓保護機4。あることを示した最近 EV、そして特に Exo、ひと心臓由来神経前駆細胞 (Exo のクリック単価) から分泌されるラット5,9心筋梗塞サイズの低減します。
Exo tetraspanins (CD63 CD81、CD9) と主要組織適合複合体などを含む、彼らの表面のタンパク質の共通セットを共有クラス I (MHC-私)。蛋白質のこの一般的なセットに加えて Exo にはもプロデューサー セル型の EV のサブセットに固有蛋白質にはが含まれています。彼らは多くの生物学的プロセス5,10を規制することにより、細胞間のコミュニケーションに重要な役割を果たすために、エキソ マーカーは重要を得ています。サイズが小さい、やりがいのある仕事の古典的な流れ cytometry (FC) のまま使用して EV を分析する簡単な方法を見つけること。
ここでは、EV 分析超遠心法による前濃縮試料、または CM (図 1) に直接適用できる FC を使用して簡略化されたプロトコルを提案する.メソッドは、追加の洗浄せず正規 Exo 関連表面抗原 (CD63、CD9、CD81) にバインドする特定の抗体をコートしたビーズを使用します。FC の分析は、測定前に調整を必要とせず、従来の cytometer を使用して実行できます。抗原流れの cytometers を使用して個々 の小さな粒子の特性評価のための方法は、さまざまなアプリケーション11,12,13に関して他のグループによって記述されています。ここでは、小さな粒子と Exo、FC によってキャプチャされた粒子の表現型解析に続いての捕獲のため機能性磁気ビーズを使用しました。このメソッドは、試験管内の任意のセル型が発表した小さな小胞の抗原組成の特性評価に使用できますが、ここで我々 ひと心臓前駆細胞 (CPC) の文化の最も適用特定細胞培養条件を提供これらの細胞によって EV の生産のための適切な環境。
Protocol
Representative Results
Discussion
従来の FC 技術のまま EV の表面に発現するタンパク質を特徴付ける最も簡単な分析法です。この点では、最も適切なプロトコルを選択する測定器の感度に起因する制限を回避することによって興味の個々 の粒子分画に関する有用な情報を取得することが重要です。Exo と下流の FC アプリケーションに適している小型 EV の表面抗原を認識する抗体が結合した磁性粒子を用いた方法について述べ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
法学は、ヘルムート ・ ホルテン財団、チューリッヒ (スイス) ベルックス財団の研究助成金によって支えられました。ビデオカードはぷ 【 毛皮ヘルツ und Kreislaufkrankheiten (スイス)、ルガーノ、セシリア オーガスタ財団スイスの全米科学財団の研究助成金によって支えられました。
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
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