细胞调理介质细胞外囊泡的流式细胞学分析
Summary
该协议描述了一种可重复的方法, 该方法设计用于细胞培养上清液, 以检测小细胞外囊泡 (ev) 上的表面表位。它利用特定的 ev 免疫沉淀使用珠子与抗体结合, 识别表面抗原 cd9, cd63 和 cd81。该方法对下游流式细胞仪分析进行了优化。
Abstract
流式细胞术 (fc) 是细胞表面抗原标志物半定量测量的首选方法。近年来, 该技术已被用于外周血和其他体液中的外细胞囊泡 (ev) (ev) 的表型分析。ev 体积小, 要求使用检测阈值在50-100 纳米左右的专用仪器。或者, ev 可以绑定到可由 fc 检测到的乳胶微珠。微珠, 与抗体结合, 识别与 ev 相关的标记–分化 cd63、cd9 和 cd81 的聚类可用于电动汽车捕获。从 cm 分离出的 exo 可以用超离心法进行预浓缩或不浓缩的分析。该方法适用于使用传统 fc 仪器的电动汽车分析。我们的结果表明, 平均荧光强度 (mfi) 值与 ev 浓度之间存在线性关系。通过超声破坏 ev 的 mfi 大幅减少, 表明该方法不能检测到膜碎片。我们报告了一种准确可靠的 ev 表面抗原分析方法, 可在任何实验室轻松实施。
Introduction
细胞分泌不同大小的细胞外囊泡 (ev), 包括微囊泡 (mv) 和外显子体 (exo)。后者可以通过大小和源亚细胞隔间来区别于 mv。mv (200–1000 nm 大小) 通过从质膜脱落从母细胞中释放。相反, exo (30–150 nm) 起源于子宫内膜, 当多泡体 (mvb) 与细胞膜1,2融合时, exo (30–150 nm) 会释放到细胞外空间。
ev 越来越多地被用作诊断生物标志物, 并可能被用作许多领域的治疗工具, 包括肿瘤学、神经病学、心脏病和肌肉骨骼疾病3, 4,5。绝大多数正在进行的使用 ev 作为治疗药物的研究利用从细胞条件下的细胞培养基 (cm) 的离体外培养细胞 (cm) 中分离出的小泡。间充质干细胞 (mscs) 在多种情况下发挥着有益的作用, msc 衍生的 ev 在心肌缺血再灌注损伤6和脑损伤7的模型中表现出了有益的效果。msc 衍生的 ev 还表现出免疫调节活性, 可用于治疗免疫排斥, 如治疗难治性移植物抗宿主病模型8所示。羊水干细胞 (hafs) 用 mv 和 exo 积极丰富 cm, 在大小 (50–1000 nm) 上分布不均匀, 介导了几种生物效应, 如分化细胞增殖、血管生成、纤维化抑制、心脏保护4。我们最近已经证明, ev, 特别是 exo, 由人类心源性祖细胞 (exo-cpc) 分泌减少心肌梗死大小的大鼠 5,9。
exo 在其表面共享一组常见的蛋白质, 包括四帕辛 (cd63、cd81、cd9) 和主要组织相容性复合体 i 类 (mhc-i)。除了这一组常见的蛋白质外, exo 还包含特定于生产者细胞类型的 ev 子集的蛋白质。exo 标记越来越重要, 因为它们在细胞间通信中起着至关重要的作用, 从而调节了许多生物过程5,10。由于电动汽车体积小, 找到一种使用经典流式细胞仪 (fc) 分析 ev 的简单方法仍然是一项具有挑战性的任务。
在这里, 我们提出了一个使用 fc 进行 ev 分析的简化协议, 该协议可应用于通过超离心或直接应用于 cm 获得的预浓缩样品 (图 1)。该方法使用带有特定抗体的珠子, 该抗体结合了规范的外源表面表位 (cd63、cd9、cd81), 无需额外清洗。fc 分析可以使用传统的细胞仪进行, 无需在测量前进行调整。其他群体在各种应用中描述了利用流式细胞仪对单个小颗粒进行抗原表征的方法11、12、13。在这里, 我们使用功能化磁珠捕获小颗粒和 exo, 然后由 fc 对捕获的粒子进行表型。虽然这种方法可以用来表征任何细胞在体外释放的小囊泡的抗原成分, 但在这里我们提供了适用于人类心脏祖细胞培养 (cpc) 和最多的特定细胞培养条件。适当的环境, 为这些细胞生产的 ev。
Protocol
Representative Results
Discussion
传统的 fc 技术仍然是表征 ev 表面标记的最直接的分析方法。在这方面, 选择最适当的协议对于通过避免因仪器灵敏度而造成的限制, 获取有关感兴趣的单个粒子分数的有用信息至关重要。我们描述了一种方法, 使用磁性颗粒结合抗体, 识别 exo 和小 ev 表面抗原, 适合下游 fc 应用。我们使用两种不同的细胞类型验证了这种方法: 初级人类 cpc 正在成为基于 exo 的心脏病治疗方法的主要细胞来源;hek293 细?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
l. b. 得到了苏黎世 (瑞士) helmut horten stiftung 和 velux stiftung 的研究赠款的支持。g. v. 得到瑞士国家科学基金会、cecilia-奥古斯塔基金会、lugano 和 shk stiftung für herz-und kreislaufkrankheiten (瑞士) 的研究赠款的支持。
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
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