Flow Cytometric analyse av ekstracellulære blemmer fra celle-conditioned Media
Summary
Protokollen beskriver en reproduserbar metode utviklet for bruk med celle kultur supernatants for å oppdage overflaten epitopes på små ekstracellulære blemmer (EV). Det bruker bestemte EV immunoprecipitation bruker perler kombinert med antistoffer som gjenkjenner overflate antigen CD9, CD63 og CD81. Metoden er optimalisert for nedstrøms flyt cytometri analyse.
Abstract
Flowcytometri (FC) er metoden for valg for semi kvantitativ måling av celle-overflate antigen markører. Nylig er denne teknikken brukt for fenotypiske analyser av ekstracellulære blemmer (EV) inkludert exosomes (Exo) i perifert blod og andre kroppsvæsker. Den lille størrelsen på EV mandater bruk av dedikert instrumenter har en gjenkjenning terskel rundt 50-100 nm. Alternativt kan EV være bundet til latex microbeads som kan gjenkjennes av FC. Microbeads, konjugert med antistoffer som gjenkjenner EV-assosiert markører/klynge av differensiering CD63, CD9 og CD81 kan brukes for EV-fangst. EXO isolert fra CM kan analyseres med eller uten pre berikelse av ultracentrifugation. Denne tilnærmingen er egnet for EV analyser konvensjonelle FC instrumenter. Våre resultater viser en lineær sammenheng mellom mener fluorescens intensitet (MFI) verdier og EV konsentrasjon. Forstyrre EV gjennom sonication dramatisk redusert MFI, indikerer at metoden ikke oppdager membran rusk. Vi rapporterer en nøyaktig og pålitelig metode for analyse av EV overflaten antigener, som lett kan implementeres i et laboratorium.
Introduction
Celler skiller ekstracellulære blemmer (EV) av forskjellige størrelser, inkludert microvesicles (MV) og exosomes (Exo). Sistnevnte kan skilles fra MV av både størrelse og subcellular rommet opprinnelsesland. MV (200 – 1000 nm i størrelse) frigis fra overordnede celler av shedding fra plasma membranen. Derimot Exo (30-150 nm) kommer fra endosomal membraner og utgis i ekstracellulære plass når multivesicular organer (MVB) smelter med cellemembranen1,2.
EV er i økende grad brukt som diagnostiske biomarkers også, muligens terapeutiske verktøy i mange områder, inkludert onkologi, nevrologi, kardiologi og musculoskeletal sykdommer3,4,5. Et stort flertall av pågående studier med EV som terapeutiske agenter utnytte isolering av blemmer fra celle-conditioned medium (CM) i vitro kulturperler celler. Stamceller (MSCs) utøve gunstige effekter i flere sammenhenger, og MSC-avledet EV har vist fordelene i modeller av hjerteinfarkt iskemi/reperfusion skade6 og hjerne skader7. MSC-avledet EV også utstillingen immun modulatory aktiviteter som kan utnyttes til å behandle uimottakelig avvisning, som vist i en modell av terapi-ildfast graft – versus – host sykdom8. Amniotic væske stamceller (hAFS) aktivt beriker CM med MVs og Exo, heterogeneously distribuert i størrelse (50 – 1000 nm), som megle flere biologiske effekter, for eksempel spredning av differensierte celler, angiogenese, hemming av fibrosis, og cardioprotection4. Vi har nylig vist at EV, og spesielt Exo, skilles ut av menneskelig hjerte-avledet progenitor celler (Exo-CPC) redusere betennelsessykdommer som hjerteinfarkt størrelse i rotter5,9.
EXO deler et felles sett av protein på overflaten deres, inkludert tetraspanins (CD63, CD81, CD9) og store histocompatibility kompleks klasse I (MHC-jeg). I tillegg til denne felles sett av proteiner, Exo også inneholde proteiner bestemt EV delsettet av produsent celle type. EXO markører er å få avgjørende betydning fordi de spiller en avgjørende rolle i mellom mobil kommunikasjon, og dermed regulerer mange biologiske prosesser5,10. På grunn av sin lille størrelse, finne en enkel måte å analysere EV med klassisk flyt cytometri (FC) er en utfordrende oppgave.
Her presenterer vi en forenklet protokoll for EV analyse med FC, som kan brukes til pre beriket prøver innhentet gjennom ultracentrifugation eller direkte til CM (figur 1). Metoden bruker perler belagt med et spesifikt antistoff som binder kanoniske Exo-assosiert overflaten epitopes (CD63, CD9, CD81) uten flere vasker. FC analyser utføres med en konvensjonell cytometer uten behov for justeringer før mål. Metoder for karakterisering av antigener på enkelte små partikler bruker flyt cytometers har blitt beskrevet av andre grupper med hensyn til ulike programmer11,12,13. Her brukte vi functionalized magnetiske perler for erobringen av små partikler og Exo, etterfulgt av phenotyping fanget partikler av FC. Selv om denne metoden kan brukes til å beskrive antigen sammensetningen av små blemmer utgitt av en celle type i vitro, gitt her vi bestemt celle kultur betingelsene som gjelder for kulturen i menneskets hjerte progenitor celler (CPC) og de riktig miljø for produksjon av EV av disse cellene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konvensjonelle FC teknikken fortsatt metoden enkleste analytisk å karakterisere indikatorer uttrykt på overflaten av EV. I denne forbindelse, er velge den mest passende protokollen avgjørende å få nyttig informasjon om individuelle partikkel fraksjoner av interesse ved å unngå begrensninger på grunn av instrumentet følsomhet. Vi beskrev en metode å bruke magnetiske partikler sammen med antistoffer som gjenkjenner Exo og små EV overflaten antigener som nedstrøms FC anvendes. Vi validert metoden bruker to ulike…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. ble støttet av forskningsmidler Helmut Horten Stiftung og Velux Stiftung, Zürich (Sveits). G.V. ble støttet av forskningsmidler Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta grunnlaget, Lugano og SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Sveits)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
