Mesure de débit par cytométrie en flux de Production de ROS dans les Macrophages en réponse à la réticulation FcγR
Summary
Cette étude démontre l’utilisation de la cytométrie à détecter une production réactives de l’oxygène (dro) résultant de l’activation de la FcγR. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les changements dans les antimicrobiens et oxydo-réduction fonction des phagocytes en réponse à des complexes immuns, micro-organismes opsonisées ou direct FcγR réticulation de signalisation.
Abstract
Le burst oxydatif ou respiratoire est utilisé pour décrire la consommation rapide d’oxygène et de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les phagocytes en réponse à divers stimuli immunitaires. ROS générées au cours de l’activation immunitaire exerce une activité antimicrobienne puissante principalement par le biais de la capacité du ROS à endommager l’ADN et les protéines, causant la mort des micro-organismes. Être capable de mesurer la production de ROS avec facilité et de façon reproductible est nécessaire afin d’évaluer la contribution des différentes voies et des molécules à ce mécanisme de défense de l’hôte. Dans cet article, nous montrent l’utilisation de sondes fluorescentes et cytométrie en flux pour détecter la production de ROS. Bien que largement utilisé, fluorescent mesure de ROS est notoirement difficile, surtout en ce qui concerne la mesure de ROS induite par des stimuli spécifiques et non mitogènes. Nous présentons une méthodologie détaillée pour détecter les ROS due à la stimulation spécifique de FcγR commençant par génération de macrophage, amorçage, coloration, FcγR réticulation et se terminant par cytométrie.
Introduction
Espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules réactives ou des radicaux libres qui sont des sous-produits de la respiration aérobie (évaluée à 1). Il s’agit de l’anion superoxyde, peroxyde, peroxyde d’hydrogène, radical hydroxyle et ions d’hydroxyle, entre autres. Dans des conditions physiologiques normales, ROS sont produites principalement par les mitochondries et les oxydases de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) et sont rapidement détoxifiés par diverses enzymes et protéines comme la superoxyde dismutase et de glutathion. Une production exagérée de ROS ou un défaut de la possibilité de supprimer les ROS peut entraîner un stress oxydatif, selon laquelle les espèces réactives de l’oxygène promouvoir les dégâts des protéines, les lipides et l’ADN entraînant stress cellulaire ou mort et les États pathologiques de la maladie. Cependant, on constate actuellement que ROS peut aussi servir de molécules de signalisation (signalisation redox) et ROS induite par la modification des différentes molécules et intermédiaires de la voie peut influer sur le métabolisme cellulaire, la prolifération, la survie, inflammatoire signalisation et le vieillissement2. Dans les cellules phagocytaires, ROS joue un rôle essentiel en fournissant une activité antimicrobienne durant la soi-disant « burst respiratoire »1,3,4,5,6. Au cours de la réaction des phagocytes à des stimuli externes, composants de la NADPH oxydase complexe (p40phox, p47phox, p67phox) translocation du cytosol vers la membrane phagosome contenant la gp91phox et p22phox sous-unités, et avec les actions de Rac1/2, forment un entièrement fonctionnel NADPH oxydase complexe enzymatique. La NADPH oxydase Assemblée puis utilise NADPH pour réduire l’oxygène de superoxyde dans la vacuole phagosome. Les anions superoxyde peuvent causer directement des dommages ou être dismutated en peroxyde d’hydrogène. Superoxyde et peroxyde d’hydrogène peuvent réagir avec d’autres molécules pour générer des radicaux hydroxyles très réactifs. Dommage est médiée par la réaction de ces ROS avec les clusters fer-soufre sur des protéines ou en provoquant une base oxydation de l’ADN, conduisant finalement à métabolisme microbien restreint ou mort du microbe5. L’importance de l’enzyme oxydase de NADPH complexe et ROS produites pendant l’explosion respiratoire est illustrée sur le plan clinique chez les patients avec maladie granulomateuse chronique (CGD)7,8,9, 10. individus avec DMC possèdent des mutations gp91phox, ce qui entraîne un manque de production de ROS et la susceptibilité aux infections récurrentes avec les bactéries et les champignons qui ne sont pas habituellement une préoccupation avec les individus immunocompétents. Par conséquent, si étudiant oxidative stress, signalisation redox ou défense de l’hôte, étant capable de mesurer la production de ROS en temps réel est un effort utile.
Plusieurs essais ont été utilisés pour la production de ROS de mesure ou les résultats du stress oxydatif11,12,13. Parmi ceux-ci, un des plus couramment utilisé est la sonde fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC2-DA)14. Cette molécule est incolore et lipophiles. Diffusion de DHFC2-DA à travers la membrane de la cellule lui permet d’être commandés par des estérases intracellulaires, qui il deacetylates en DHFC2, rendant la cellule imperméable. Les actions de plusieurs types de ROS (peroxyde d’hydrogène, peroxynitrite, les radicaux hydroxyles, oxyde nitrique et radicaux peroxy) sur DHFC2 il s’oxyder en DCF qui est fluorescent (déclarés Ex / Em : 485-500 nm/515-530 nm) et peut être détecté à l’aide d’un flux cytomètre équipé d’un filtre standard défini pour la fluorescéine (FL1 canal). Superoxyde ne réagit pas fermement avec DHFC2 mais elle peut réagir avec une autre sonde dihydroethidium (DHE) pour donner le produit fluorescent 2-hydroxyethidium (ainsi que d’autres produits d’oxydation de superoxyde indépendant fluorescent)15. Les produits fluorescents d’oxydation DHE peuvent être détectés à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 518 nm et une longueur d’onde d’émission de 605 nm (FL2 canal). Bien que relativement simple d’utilisation, utilisation de ces sondes de détection de ROS nécessite une connaissance de leurs limites et intégration minutieuse de coloration des procédures et des contrôles dans le dosage spécifique en cours afin d’avoir valide expérimentale résultats et conclusions. Le protocole suivant illustre l’utilisation d’un kit disponible dans le commerce qui emploient ces 2 sondes conçues pour mesurer les ROS par cytométrie en flux. Nous avons tache apprêtées macrophages dérivés de la moelle osseuse avec ces sondes et induire la production de ROS par réticulation FcγR. Nous présentons des données représentatives obtenues à l’aide de ce protocole et insister sur les précautions appropriées doivent être entrepris dans une expérimentation réussie.
Protocol
Representative Results
Discussion
DHFC2-DA et détection DHE de ROS est une technique largement utilisée14,15. Facilité d’utilisation et l’adaptabilité de ces sondes ROS pour les formats microplaques cinétiques, analyse de fluorescence microscopie ou flux de cytométrie de flux a contribué à leur popularité. Toutefois, dans nos études des fonctions de médiation FcγR macrophage, il semblait être un protocole standard pour la réalisation de cet essai pour cytométrie de F…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les autres membres du laboratoire Tigno-Aranjuez notamment Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy et Roopin Singh pour leur aide dans l’entretien de colonie entretien et de la souris de laboratoire. Cette recherche a été fourni par R00 HL122365 de subventions et de fonds de démarrage à J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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