Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von ROS-Produktion In Makrophagen als Reaktion auf FcγR Vernetzung
Summary
Diese Studie zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) Produktion durch Aktivierung der FcγR zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, Änderungen in der antimikrobiellen und Redox signaling Funktion der Phagozyten in Reaktion auf Immunkomplexe, opsonized Mikroorganismen oder direkte FcγR Vernetzung zu beurteilen.
Abstract
Die oxidative oder respiratorische Burst wird verwendet, um den schnellen Verbrauch von Sauerstoff und Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beschreiben durch Phagozyten in Reaktion auf verschiedene Reize immun. ROS erzeugt während der Immunaktivierung übt starke antimikrobielle Aktivität vor allem durch die Fähigkeit von ROS, DNA und Proteine, beschädigen Tod von Mikroorganismen verursacht. ROS-Produktion mit Leichtigkeit und reproduzierbar messen ist notwendig, um den Beitrag der verschiedenen Wege und Moleküle zu diesem Mechanismus der Host Verteidigung zu bewerten. In diesem Papier wir zeigen die Verwendung von fluoreszierenden Sonden und flow Cytometry um ROS-Produktion zu erkennen. Obwohl weit verbreitet, wird Fluoreszenz Messung von ROS notorisch problematisch, vor allem im Hinblick auf die Messung von ROS durch spezifische und nicht Mitogene Reize induziert. Wir präsentieren Ihnen eine detaillierte Methode um ROS erzeugt durch spezifische FcγR Stimulation beginnend mit Makrophagen-Generierung, Grundierung, Färbung, FcγR Vernetzung und endend mit durchflusszytometrischen Analyse zu erkennen.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind reaktive Moleküle oder freie Radikale, die Nebenprodukte der aeroben Atmung (rezensiert in 1). Dazu gehören die Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid, Wasserstoffperoxid, Hydroxyl-radikal und Hydroxyl-Ionen, unter anderem. Unter normalen physiologischen Bedingungen ROS entstehen vor allem durch die Mitochondrien und Nicotinamid Adenin Dinucleotide Phosphat (NADPH) Oxidasen und werden schnell durch verschiedene Enzyme und Proteine wie Superoxid-Dismutase und Glutathion entgiftet. Eine übertriebene Produktion von ROS oder ein Defekt in der Fähigkeit, ROS entfernen führt zu oxidativem Stress, wobei reaktive Sauerstoffspezies den Schaden der Proteine, Lipide und DNA zu zellulären Stresses oder Tod und pathologischen Krankheitszuständen führen zu fördern. Allerdings ist es derzeit geschätzt, dass ROS kann auch als Signalmoleküle (Redox signaling) fungieren, und ROS-vermittelten Modifikation verschiedener Moleküle und Weg Zwischenprodukte zellulären Stoffwechsel, Vermehrung, überleben, entzündliche beeinflussen Signalisierung und Alterung2. In phagocytic Zellen spielt ROS eine wesentliche Rolle bei der Bereitstellung von antimikrobielle Aktivität während der sogenannten “respiratorischen Burst”1,3,4,5,6. Während die Reaktion der Phagozyten auf äußere Reize translozieren Komponenten von der NADPH-Oxidase Komplex (p40Phox, p47Phox, p67Phox) aus dem Zytosol der phagosomal Membran mit gp91phox und p22phox Untereinheiten, und zusammen mit den Maßnahmen der Rac1/2 bilden eine voll funktionsfähige NADPH Oxidase Enzymkomplex. Die montierten NADPH-Oxidase nutzt dann NADPH um Sauerstoff zu Superoxid innerhalb der phagosomal Vakuole zu reduzieren. Superoxid-Anionen können direkt schädigen oder in Wasserstoffperoxid dismutated werden. Superoxid und Wasserstoffperoxid reagieren mit anderen Molekülen, hochreaktive Hydroxyl-Radikale zu generieren. Schaden wird durch Reaktion von diesen ROS mit Eisen-Schwefel-Clustern auf Proteine oder durch Basis Oxidation von DNA, die letztlich zu beschränkten mikrobiellen Stoffwechsel oder Tod der Mikrobe5vermittelt. Die Bedeutung der NADPH-Oxidase Enzymkomplex und ROS produziert während der respiratorischen Burst zeigt klinisch bei Patienten mit chronisch granulomatöse Erkrankung (CGD)7,8,9, 10. Personen mit CGD besitzen Mutationen im gp91phox, was zu einem Mangel der ROS-Produktion und Anfälligkeit für rezidivierende Infektionen mit Bakterien und Pilzen, die nicht in der Regel ein Anliegen mit immunkompetenten Individuen sind. Deshalb ob oxidativer Stress, Redox signaling oder Host Verteidigung, die Möglichkeit, Messen ROS-Produktion in Echtzeit ein nützliches Unterfangen.
Mehrere Proben wurden an die Maßnahme ROS Produktion oder die Ergebnisse von oxidativem Stress11,12,13genutzt. Unter diesen ist eine der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Sonde 2′, 7′ Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (RLKV2-DA)14. Dieses Molekül ist farblos und lipophil. Diffusion von RLKV2-DA in der Zellmembran ermöglicht es, von intrazellulären Esterasen, einwirken lassen, die es in RLKV2 deacetylates, wodurch es Zelle undurchlässig. Die Aktionen von mehreren Arten von ROS (Wasserstoffperoxid, Peroxynitrit, Hydroxyl-radikale, Stickstoffmonoxid und Peroxy radikale) auf RLKV2 oxidieren es in DCF, fluoreszierende (gemeldeten Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) und kann eine Strömung erfasst werden CYTOMETER ausgestattet mit einem standard-Filter für Fluorescein (FL1 Kanal) festgelegt. Superoxid reagiert nicht stark mit RLKV2 aber mit einer anderen Sonde Dihydroethidium (DHE) liefern die fluoreszierenden Produkt 2-Hydroxyethidium (sowie andere fluoreszierende Superoxid-unabhängige Oxidationsprodukte)15reagieren kann. Die fluoreszierende Produkte der DHE Oxidation können erkannt werden, mit Hilfe einer Anregung Wellenlänge von 518 nm und einer Emissionswellenlänge von 605 nm (FL2 Kanal). Obwohl relativ einfach zu bedienen, erfordert Nutzung diese Sonden für die Erkennung von ROS wissen über ihre Grenzen und sorgfältige Einarbeitung der Färbung Verfahren und Kontrollen in den spezifischen Assay wird durchgeführt, um gültige experimentelle Ergebnisse und Schlussfolgerungen. Das folgende Protokoll veranschaulicht die Verwendung eines handelsüblichen Kits mit diesen 2 Sonden durch Durchflusszytometrie ROS messen soll. Wir färben grundierte Knochenmark stammenden Makrophagen mit diesen Sonden und ROS-Produktion durch FcγR Vernetzung zu induzieren. Wir präsentieren repräsentative Daten unter Verwendung dieses Protokolls und betonen entsprechende Vorsichtsmaßnahmen, die für erfolgreiche Experimente durchgeführt werden müssen.
Protocol
Representative Results
Discussion
RLKV2-DA und DHE-basierte Erkennung von ROS ist eine weit verbreitete Technik14,15. Einfache Bedienung und die Anpassungsfähigkeit der diese ROS-Sonden für kinetische Mikrotestplatte Formate hat Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow durchflusszytometrischen Analyse zu ihrer Beliebtheit beigetragen. Jedoch in unseren Studien FcγR-vermittelten Makrophagen Funktionen schien es kein Standardprotokoll für die Durchführung dieses Assays für durchflusszytom…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten anderen Mitgliedern des Tigno-Aranjuez Labor einschließlich Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy und Roopin Singh für ihre Hilfe im Labor Unterhalt und Maus Kolonie Wartung danken. Unterstützung für diese Forschung lieferte Grant R00 HL122365 und Startkapital J.T.T-a.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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