Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ved hjælp af Sniper-Cas9 til at minimere Off target effekter af CRISPR-Cas9 uden tab af målaktiviteten Via styret Evolution

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/59202
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1ToolGen
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at optimere CRISPR-Cas9 for at opnå en højere specificitet uden tab af målaktivitet. Vi bruger en styret evolution tilgang kaldet Sniper-skærmen til at finde en mutant Cas9 med de ønskede egenskaber. Sniper-Cas9 er kompatibel med afkortede single-guide RNA'er og levering i et ribonucleoprotein format, velkendte strategier for at opnå højere specificiteter.

Abstract

Udvikling af klynger regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)-forbundet protein 9 (Cas9) i terapeutiske metoder kræver undgåelse af konsekvenserne potentielt skadelige off-målet. Flere metoder har været udtænkt til at mindske sådanne virkninger. Her præsenterer vi en Escherichia coli-baseret styret evolution metode kaldet Sniper-skærmen for at få en Cas9 variant med optimeret specificitet og fastholdt på målet aktivitet, kaldet Sniper-Cas9. Ved hjælp af Sniper-skærm, kan positive og negative valg udføres samtidigt. Skærmen kan også gentages med andre single-guide RNA (sgRNA) sekvenser til at berige for sandt positive hits. Ved hjælp af CMV-PltetO1 dual initiativtageren til at udtrykke Cas9 varianter, kan udførelsen af biblioteket poolede kontrolleres hurtigt i pattedyrsceller. Metoder til at øge specificiteten af Sniper-Cas9 er også beskrevet. For det første har anvendelse af trunkerede sgRNAs tidligere vist sig at øge Cas9 specificitet. I modsætning til andre manipuleret Cas9s bevarer Sniper-Cas9 et wild-type (WT) niveau-target aktivitet når de kombineres med afkortede sgRNAs. Andet, levering af Sniper-Cas9 i en ribonucleoprotein (RNP) format i stedet for et plasmid format er muligt uden at påvirke dens målaktivitet.

Introduction

I dette papir, vi sigter mod at forbedre specificiteten af Cas9 ved at kombinere forskellige strategier. Forskellige metoder til at undgå off target effekter af CRISPR-Cas9 er blevet udviklet. For eksempel, kan afkortet sgRNAs bruges til at opnå højere specificitet1. Derudover kan metoden for Cas9 levering ændres fra en plasmid format til en RNP format til at opnå højere specificitet2. Specifikke aminosyrerester af Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) protein er blevet ændret efter den rationelt design tidligere beskrevet3,4,5. Alternativt aminosyrerester har ændret sig i en tilfældig måde og Cas9 varianter med den højeste specificitet blev identificeret ved hjælp af enten en gær6 eller en E. coli7,8 screening system.

Men mange grupper har rapporteret at Cas9 varianter manipuleret ved hjælp af design til at svække uspecifik samspillet mellem Cas9 og den substrat udstille lav på target aktiviteter7,8,9, 10 , 11 , 12. vi udviklede en E. coli-baseret styret evolution system, Sniper-skærmen, at screene tilfældigt mutagenized Cas9 varianter. En E. coli screening system har fordele frem for en gær system på grund af de hurtigere fordobling tid og højere transformation effektivitetsgevinster af E. coli.

Både negative og positive valg, baseret på tre forskellige plasmider og et gen af interesse (GOI) integreret i genomet E. coli anvendes i Sniper-skærmen. Cas9 varianter er udtrykt under ordningen CMV-PltetO1 dual-promotor af en lav-kopi nummer plasmid så at kandidater identificeret i E. coli kan testes i pattedyrceller uden behov for subcloning. Den indiske regering er indført i E. coli genom ved hjælp af Tn7 transposon system. SgRNA plasmid, som indeholder en temperatur-følsomme oprindelse af replikering, udtrykker en sgRNA rettet mod den indiske regering; dog er sgRNA og indiske sekvenser ikke perfekt afstemt. En perfekt afstemt sgRNA mål-webstedet findes på en tredje plasmid indeholdende ccdB -genet, som koder en dødbringende produkt, der forgifter gyrase. I dette system, er celler, der udtrykker Cas9 varianter med høj off mål aktiviteter fjernet fordi dobbelt-strenget pauser (DSBs) føres ind i det forkerte stedet ligger i genomisk DNA. På den anden side er celler, der udtrykker Cas9 varianter med lav på target aktiviteter også fjernet på grund af dødbringende ccdB genekspression. Udtryk niveauet af varianter af Cas9 kan ændres ved at ændre koncentrationen af anhydrotetracycline (ATC), der justerer udvalg kraft.

Vi begrundet at lokalisere uoverensstemmende sgRNA mål-webstedet i genomisk DNA og ikke på en plasmid ville øge følsomheden af systemet. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at der er kun én genomisk websted, der henviser til, at der ville være mange plasmider, hver indeholder et målwebsted inden for en enkelt E. coli celle.

Ved hjælp af dette system, identificeret vi en Cas9 variant, Sniper-Cas9, som viser WT-niveau på target aktiviteter og reduceret off mål aktiviteter i forhold til WT Cas9. Sniper-Cas9 kan opnå endnu højere specificitet nøgletal ved hjælp af trunkerede sgRNAs eller RNP-baserede levering snarere end plasmid-baserede levering.

Protocol

1. integration af en menneskelig GOI i BW25141 E. coli -stamme

  1. Kloning af den indiske regering
    1. Polymerasekædereaktionen (PCR) forstærke en 500 bp længde af en menneskelig GOI indeholdende forskellige kandidat målwebsteder via standard PCR metoder med primere, der indeholder NotI og XhoI begrænsning enzym websteder.
      Bemærk: I dette eksperiment, den indiske regering var det menneskelige EMX1 genet.
    2. Fordøje både PCR produkt og pgrg3613 vektor med NotI og XhoI-restriktionsenzymer.
    3. Gel rense de ønskede fragmenter (500 bp og 12 kb).
    4. Ligate fragmenter sammen ved hjælp af T4 ligase. For at gøre dette, Bland 50 ng af fordøjet pgrg36 og 6 ng af PCR Indsæt i en reaktion volumen af 20 μL indeholdende 1 x ligase buffer og 0,5 U ligase enzym. Inkuber ved stuetemperatur (RT) natten over.
    5. Omdanne den sammenskrevne plasmid til DH5-α kompetente celler. Vokser den resulterende transformants på Luria bouillon (LB) agar plader der indeholder ampicillin (100 μg/mL) ved 32 ° C, og der inkuberes natten over. Afhente en koloni og dyrke det i LB medier indeholdende ampicillin natten over. Isolere plasmid DNA fra den E. coli, ved hjælp af en kommercielt tilgængelig miniprep Kit. Bekræfte indsættelsen af den indiske regering fragment af Sanger sekventering plasmid fra mini plasmid forberedelse (mini prep)13.
  2. Forberedelse af BW25141 -GOI
    1. Omdanne den fremkomne pgrg36 -GOI plasmid til BW25141 E. coli -stamme. Det er vigtigt at bruge en BW25141 stamme for at minimere antallet af falsk positive kolonier.
    2. Vokse de transformerede celler i LB buffer ved 32 ° C natten over. Indiske regering er indsat i BW25141 stammen (BW25141 -GOI) genomisk DNA. Fjerne pgrg36 -GOI plasmidet fra BW25141 -indiske stammen ved hjælp af standard pgrg36 protokol13. Kort, fortynde en koloni (ca. 107-fold) og dyrke det på en LB plade på 42 ° C natten over. Streak kolonierne på LB-tallerkenen og dyrke dem på 42 ° C natten over.
    3. Bekræfte den korrekte GOI indsættelse af kolonien PCR, ved hjælp af primere foreslog i pgrg36 protokol: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 'og 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3'. Primeren forstærker genomisk DNA indsættelsesstedet, og størrelsen af den resulterende PCR produkt vil være 904 bp plus størrelse i indsætte (500 bp i dette tilfælde).
    4. Forberede electrocompetent BW25141 -GOI celler (en detaljeret protokol er beskrevet i trin 3.2.6–3.2.10).

2. forberedelse af Cas9 variant bibliotek

  1. Biblioteket forberedelse
    1. Omdanne Cas9 vektor7 i en kommerciel E. coli mutator stamme (Table of Materials) og Følg fabrikantens instruktioner for at opnå en variant bibliotek (Mutator bibliotek).
    2. Udføre fejlbehæftet PCR på den hele WT Cas9 sekvens i Cas9 vektor, ved hjælp af en fejlbehæftet PCR kit (Tabel af materialer).
      Bemærk: Lav fejlprocent protokollen blev vedtaget i sagen Sniper-Cas9 at undgå at forstyrre den oprindelige funktion af proteinet.
    3. Fordøje Cas9 vektor med passende restriktionsenzymer. Gel rense PCR produktet (fra trin 2.1.2) og fordøjet rygraden.
      Bemærk: Størrelsen af SpCas9-genet er omkring 4,3 kb. XhoI og KpnI blev valgt til at fordøje pBLC-SpCas9 vektor, som blev brugt i sagen Sniper-Cas9.
    4. Samle rygraden fragment (fra trin 2.1.3) og Indsæt forstærkes ved hjælp af fejlbehæftede PCR (fra trin 2.1.3) via isotermisk i vitro rekombination.
      Bemærk: mere end 500 ng af rygraden er nødvendig for at opnå en høj koncentration af bibliotek (fejlbehæftet PCR [EP] bibliotek). To forskellige fejlbehæftet PCR kits blev brugt til at forberede EP biblioteker i sagen Sniper-Cas9 (EP bibliotek I og II).
    5. Rense produkter fra forsamlingen (fra trin 2.1.4) ved hjælp af en DNA rensning kit, der giver mulighed for lav-volumen eluering (Tabel af materialer). Elueres med 6 μL nukleasen-gratis vand (NFW) og måle koncentrationen af DNA.
    6. Omdanne mere end 500 ng af Cas9 bibliotek vektor (for hver af tre biblioteker) i 50 μL af electrocompetent E. coli celler (Tabel af materialer). Se elektroporation protokol i trin 3.2.1-3.2.4. Til dette bibliotek forberedelse, brug 1 mL af SOC medium i stedet for 250 μL per 50 μL af kompetente celler.
    7. Gøre 1: 100, 1:1, 000, og 1:10,000 fortyndinger af den blanding, der indeholder de gendannede celler med SOC medium. Plade 100 mm LB agar plader suppleret med chloramphenicol (12,5 μg/mL) fortyndet cellerne. Plade de resterende celler på en 245 mm2 plade. Der inkuberes ved 37 ° C natten over.
  2. Beregning af bibliotek kompleksitet
    1. Fotografere fortynding pladerne via en gel dokumentationssystem eller et almindeligt digital kamera. Køre OpenCFU software14 og uploade billeder af fortynding plader. Indstille tælle området inde i en plade og fjerne falske kolonier.
    2. Manuelt mangedoble antallet af kolonier af fortyndingsfaktoren at opnå det oprindelige antal transformants. Konvertere disse numre i logaritmisk form (base 10). Beregne gennemsnittet for at bestemme kompleksiteten af biblioteket.
    3. Når den ønskede kompleksitet værdi er opnået, samle alle kolonierne på 245 mm firkantet plade (fra trin 2.1.7) ved hjælp af en spreder og 20 mL af LB suppleret med chloramphenicol. Ikke vokse de indsamlede kolonier og rense plasmid biblioteket ved hjælp af en kommerciel midiprep kit.
      Bemærk: Jo højere bibliotek kompleksitet, jo bedre. Når Sniper-Cas9 blev identificeret, blev en mangfoldighed af 3 x 106 opnået for hvert bibliotek.

3. positive og negative screening for udvikling Cas9

  1. Valg af observationsområde og plasmid konstruktion
    1. Vælg en target sgRNA spacer sekvens i den indiske regering. Erstatte et eller to rester i den tilfældige nukleotid til at producere en mismatched sekvens.
      Bemærk: Menneskelige EMX1 målwebstedet 3 (GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA med GGG PAM) blev brugt i sagen Sniper-Cas9. Followings er de forkerte sekvenser brugt: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA og GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA.
    2. Indsæt den mismatched sekvens (Se trin 3.1.1) ind i det sgRNA plasmid ved hjælp af standard oligonukleotid (oligo) kloning procedurer7.
    3. Indsæt den mismatched sekvens med en PAM i 3'-slutningen i p11-lacY-wtx1 (Table of Materials) til at konstruere den ccdB plasmid ved hjælp af standard oligo kloning procedurer15.
  2. Forberedelse af Sniper-screening E. coli kompetente celler
    1. Optø BW25141 -GOI electrocompetent celler på is.
    2. Tilføj 1 ng ccdB plasmid og sgRNA plasmid med dobbelt uoverensstemmelser i 50 μL af optøede BW25141 -GOI celler. Forsigtigt blandes cellerne af pipettering og flytte dem ind i en prechilled 0,1 cm elektroporation kuvette.
    3. Transformer E. coli med de to plasmider via elektroporation. Tilsæt 250 μL af SOC medium umiddelbart efter elektroporation. Forsigtigt afpipetteres løsning for at blande cellerne og medium. Overfør blandingen til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
      Bemærk: For maksimal effektivitet, indstille spændingen på 1,80 kV og runtime skal være mellem 4,8 ms og 5,0 ms.
    4. Genskab de transformerede celler og inkuberes dem ved 32 ° C i 1 time med blid ryster.
    5. Plade 125 μL af de gendannede celler på en ampicillin (50 μg/mL) / kanamycin (25 μg/mL) LB-agar plade (kultur betingelse). Plade de resterende celler på en ampicillin/kanamycin/arabinose (1,5 mg/mL) LB agar plade (ccdB-udtrykker betingelse). Der inkuberes ved 32 ° C natten over.
    6. Check for fravær af overlevende kolonier på ccdB-at udtrykke betingelse plade. Samle kolonier fra kultur betingelse plade ved hjælp af en spreder og kultur dem i 250 mL af super optimal bouillon (SOB) medium suppleret med 50 μg/mL ampicillin og 25 μg/mL af kanamycin ved 32 ° C, med blid ryster.
    7. Når det optiske densitet på 600 nm (OD600) når 0,4, chill kolbe på is. Forberede prechilled ionbyttet vand og en prechilled 10% glycerol løsning (sterilisere før brug).
    8. Der centrifugeres (ved 4.000 x g i 5 min. ved 4 ° C) i celler og supernatanten. Der tilsættes 200 mL prechilled ionbyttet vand. Resuspend celler ved hjælp af 10 mL serologisk pipette. Gentag dette trin 3 x.
    9. Cellerne vaskes med 50 mL af prechilled 10% glycerol løsning. Der centrifugeres dem som før (på 4.000 x g i 5 min. ved 4 ° C).
    10. Supernatanten og resuspenderes i 300 μl af 10% glycerol løsning. Gøre 50 μL delprøver og fryse dem i flydende kvælstof. Gemme celler (Sniper-screening celler) ved-80 ° C.
  3. Sniper-screening
    1. Omdanne Sniper-screening celler (fra trin 3.2.10) med 100 ng af Cas9 variant plasmider fra hvert bibliotek (fra trin 2.2.3.See trin 2.1.1 og 2.1.4). Følge af elektroporation fremgangsmåden beskrevet i trin 3.2.1–3.2.3.
    2. Overføre 250 μL af cellerne til en frisk 1,5 mL microcentrifuge tube. Tilføje 250 pg af ATC at gøre en slutkoncentration på 10 ng/mL. Gendanne både ATC-holdige og ATC-gratis celler (Se trin 3.2.4 for recovery trin).
    3. Plade 25 μL af gendannede ATC-gratis celler på en chloramphenicol/kanamycin LB-agar plade (nonselective betingelse). Tilføje ATC til de gendannede ATC-holdige celler til at gøre en endelig koncentration på 100 ng/mL på en 245 mm LB plade. Straks plade celler på en chloramphenicol/kanamycin/arabinose LB agar plade (selektiv betingelse). Der inkuberes natten over ved 32 ° C.
      Bemærk: Størrelsen og antallet af LB-tallerkenen bestemmes af størrelsen af mangfoldighed af screening dækker. I forbindelse med en 100 mm petriskål med 20 mL af LB, tilføje 2 μg af ATC.
    4. Fotografere pladerne. Tæl antallet af levedygtige kolonier ved hjælp af OpenCFU software14. (Se trin 2.2.1) Sørg for, at antallet af kolonier på den nonselective plade er mindst 10 x større end mangfoldighed af biblioteket for at dække alle varianter.
    5. Beregne overlevelse frekvens som følger.
      Overlevelse frekvens = antallet af kolonier på en selektiv plade / (antallet af kolonier på en nonselective plade x 10)
    6. Pool kolonierne, at overlevet på selektiv pladerne fra alle tre biblioteker. Inkuber de overlevende kolonier i 250 mL af LB medium suppleret med 12,5 μg/mL chloramphenicol på 42 ° C natten over. Isolere den screenede Cas9 bibliotek DNA ved hjælp af en midiprep kit.
      Bemærk: Dette trin rydder sgRNA plasmid.
    7. Gentages screeningen fra trin 3.3.1–3.3.6 indtil overlevelse frekvens når et plateau. Brug 10 ng af den valgte Cas9 plasmid for transformation og 10 ng/mL af ATC under genoprettelsen. Opretholde ATC koncentration på 100 ng/mL for den selektive betingelse.
  4. Blande og anden screening
    1. Bland de valgte poolede varianter ved hjælp af følgende DNA-blander protokollen. PCR forstærke Cas9 Indsæt i Cas9 plasmid bruger flankerende primere, 150 nukleotider fra Indsæt grænser. Digest 2 μg amplificerede PCR produkt med DNase jeg i 1 minut ved 37 ° C.
    2. Rense fragmenter 70-200 bp i længde ved hjælp af 2% Agarosen gelelektroforese. PCR forstærke de renset fragmenter. Brug produktet som en skabelon til PCR forstærke Cas9 Indsæt med passende primere flankerer Cas9. Bruge den endelige PCR produkt til at konstruere et Cas9 bibliotek, som beskrevet i trin 2.1.4.
    3. Udarbejde nye Sniper-screening celler (Se afsnit 3.2) med en anden uoverensstemmelse mellem sgRNA plasmid (Se trin 3.1.1). Redo screeningsprocessen (afsnit 3.2-3.3) indtil overlevelse sats når et plateau. Brug 10 ng af den valgte Cas9 plasmid for transformation og 10 ng/mL ATC under genoprettelsen. Opretholde ATC koncentration på 10 ng/mL for den selektive betingelse.
  5. Udvalg af udviklet Cas9 mutant plasmider
    1. Efter den sidste screening trin, tilfældigt vælge et hundrede kolonier fra den selektive plade og kultur dem i chloramphenicol-holdige LB medium på 42 ° C natten over.
    2. Isolere plasmider ved hjælp af en miniprep procedure og Sanger-sekvens indsætter ved hjælp af sekventering primere inden for Cas9.
    3. Vælg de top tre mest hyppige varianter at teste dem i menneskelige cellelinjer.

4. levering af Cas9 som en RNP med afkortet sgRNA

  1. Gen måludvælgelser ved hjælp af Cas-OFFinder
    1. Vælge målwebsteder med Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Vælg den relevante for den specifikke type Cas9 og target genom PAM (menneskelige, mus, zebrafisk, osv.). Udfylde fanen forespørgsel sekvenser , vælge den der er uoverensstemmelse mellem antallet, og klik på Send -knappen.
    2. Efter et par sekunder, på mål (med en uoverensstemmelse i antallet af '0') og off målwebsteder vil vises. Generelt Vælg off target websteder med en til tre uoverensstemmelser.
  2. Forberedelse af skabelonen sgRNA
    1. Bestil crRNA og tracrRNA oligos med de følgende skabelon sekvenser, nemlig crRNA sekvens: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'; tracrRNA rækkefølge: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'. Udfyld crRNA sekvens med target sekvensen fremstillet i trin 4.1.2 N20. At designe afkortet sgRNAs, fjerne baser fra 5'-enden at opnå N19, N18 eller N17 sgRNA sekvenser.
    2. Forberede PCR-blandingen til forstærkning af sgRNA-kodning sekvensen som følger: kombinere 10 μL af 5 x buffer, 0,5 μl af crRNA oligo (100 pmol/μl), 0,5 μl af tracrRNA oligo (100 pmol/μl), 2,5 μL af dNTP'er (10 mM), 0,5 μl DNA polymerase , og 36 μL af NFW (tabel af materialer).
    3. Forstærke skabelonen ved hjælp af følgende betingelser, nemlig for det første denaturering: 1 min på 98 ° C; til denaturering, udglødning og udvidelse: 10 s på 98 ° C, 15 s ved 54 ° C, 20 s ved 72 ° C i 25 cykler; for den endelige udvidelse: 5 min på 72 ° C.
    4. Analysere 2 μl af skabelonen amplificerede DNA (fra trin 4.2.3) på en 2%-agarosegel. Rense skabelonen ved hjælp af en PCR rensning kit.
      Bemærk: Størrelsen af DNA-template er 125 bp.
  3. Syntese af sgRNA
    1. Forberede reaktionsblandingen til sgRNA syntese som følger: kombinere 8,5 μL af DNA-template (fra trin 4.2.3), 1 μL af UTP (25 mM), 1 μL af CTP (25 mM), 1 μL af GTP (25 mM), 1 μL af ATP (25 mM), 4,2 μL MgCl2 (100 mM) , 4,5 μL af T7 RNA polymerase (50 U/μl), 3 μl af 10 x T7 RNA polymerase buffer, 1,2 μL pyrophosphatase (0,5 U/μL), 0,75 μL af RNase inhibitor (40 U/μL) og 4,2 μL af NFW.
    2. Inkuber reaktionsblanding ved 37 ° C natten over (mindst 10 h). Tilsæt 0,5 μL af DNase (2 U/μL) til reaktionsblandingen og inkuberes ved 37 ° C i 15-30 min. rense sgRNA bruger et RNA oprensning kit.
    3. For at reducere toksiciteten forårsaget af en medfødt immunrespons udløst af 5'-trifosfat på sgRNA16, fjerne 5'-trifosfat fra guide RNA'er med kalv intestinal alkalisk fosfatase (CIP) som følger: behandle 10 µg af in vitro- transskriberede RNA med 250 U af CIP i 3 timer ved 37 ° C i overværelse af 100 U af RNase inhibitor. Rense CIP-behandlede sgRNA bruger et RNA oprensning kit.

5. WT og Sniper Cas9 protein proteinekspression og -oprensning

  1. Protein udtryk i E. coli
    1. Omdanne pET plasmider18 kodning hans markeret WT - og Sniper-Cas9 i BL21 (DE3) E. coli stamme.
    2. Podes 50 mL af LB medie som indeholder 50 μg/mL kanamycin med en frisk koloni husly pET-Cas9 udtryk plasmid og ryste det natten over (200 rpm) ved 37 ° C (preculture).
    3. Overfør 10 mL af overnight kultur til 500 mL frisk LB medium indeholder 50 μg/mL kanamycin. Inkuber kultur med rysten (200 rpm) ved 37 ° C i 2 timer.
    4. Overvåge OD600 , indtil kulturen når midten log fase af vækst (OD600 ≈ 0,6-0,7).
    5. Inducerer udtryk for WT eller Sniper Cas9 protein med isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, i en endelig koncentration på 0,25 nM). Inkuber kultur ved 18 ° C natten over.
  2. Protein oprensning
    1. Høste cellerne ved centrifugering ved 5.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    2. Resuspenderes i lysisbuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 4 mM dithiothreitol [DTT], 5 mM benzamidine, 100 mM phenylmethylsulfonyl fluor [PMSF], pH 8) på 20 mL pr. gram vådvægt.
    3. Tilføje PMSF, DTT og lysozym til en endelig koncentration på 1 mg/mL hver og inkuberes blanding på is i 30 min.
    4. Der sonikeres celler på is. Puls gentagne gange for 10 s på 200 – 300 W med en 10 s afkøling periode mellem hver puls, for en samlet tid på 20 min.
    5. Der centrifugeres i lysate ved 6.000 x g i 30 min. ved 4 ° C.
    6. Fjern supernatanten til en frisk tube. Tilsæt 1 mL af hans binde Agarosen harpiks til 5 mL ryddet lysate og Ryst forsigtigt i 1 time ved 4 ° C.
    7. Indlæse lysate/hans-Bind Agarosen harpiks blandingen på en kolonne med et udjævnet bunden outlet.
    8. Fjern bunden hætten og indsamle flow-gennem kolonnen.
    9. Vaske kolonnen 2 x med vaskebuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8); indsamle vask brøkdel for analyse af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE).
    10. Elueres protein 10 x med 1 mL af eluering buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8), indsamle prøver for SDS-PAGE.
    11. Koncentrere elueret WT - eller Sniper-Cas9 protein ved hjælp af en 100 kDa kolonnefilter. Opbevare prøverne i en opløsning af 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl og 50% glycerol ved-80 ° C.

6. RNP levering

  1. Transfektion og forberedelse af celler til RNP levering
    1. Opretholde HEK293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotika ved 37 ° C med 5% CO2.
    2. Bland WT eller Sniper Cas9 protein (2 μg) med sgRNA (2 μg) og inkuberes i 10 min. ved RT at gøre RNP komplekser.
    3. Trypsinize og tælle cellerne. Forberede 2 x 104 celler pr. én reaktion. Cellerne vaskes med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og der centrifugeres. Opsug supernatanten og resuspenderes med elektroporation buffer.
    4. Electroporate RNP komplekser i celler ved hjælp af følgende indstillinger, nemlig 1.300 V, 30 ms, og en puls. Plade celler på en 48-godt tallerken fyldt med 500 μl af DMEM suppleret med FBS og antibiotika (som beskrevet i trin 6.1.1) lige efter elektroporation. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
    5. Isolere genomisk DNA med en gDNA forberedelse kit, 48 timer efter Transfektion.

7. Transfektion af plasmider kodning Sniper-Cas9 og sgRNA

  1. Opførelse af en sgRNA plasmid
    1. Bestil frem og bak oligos med de følgende skabelon sekvenser, nemlig frem: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; omvendt: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'. Erstatte N20 med target sekvensen fremstillet i trin 4.1.2. Forkorte target sekvens til en længde på N19, N18 eller N17 at syntetisere afkortet sgRNA.
    2. Anneal begge oligos i 1 x T4 DNA ligase buffer.
    3. Fordøje pRG2 vektor med BsaI begrænsning enzym.
    4. Gel rense fordøjet vektoren (3.300 bp) ved hjælp af en 0,8%-agarosegel.
    5. Ligate den udglødet oligo og renset fragmentet ved hjælp af T4 ligase på 37 ° C: mix 50 ng af fordøjet pRG2 og 1 ng af udglødet oligo i en reaktion volumen af 20 μL. Der inkuberes ved RT i 15 min.
    6. Omdanne DH5 alpha stamme ligatur blandingen og vokse transformants på LB agar plader der indeholder ampicillin (100 μg/mL) ved 37 ° C. Bekræfte indsættelse af oligo i vektoren af standard sekventering.
  2. Transfektion af plasmider kodning Sniper-Cas9 og sgRNA
    1. Opretholde HEK293T celler i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 ° C med 5% CO2. Dagen før Transfektion, trypsinize og tælle cellerne. Når du arbejder på en 48-godt skala, plade 1 x 105 celler pr. brønd i 250 μL af komplet vækstmediet. Cellerne skal være 50%-80% sammenflydende på dagen for Transfektion.
    2. På den 48-godt skala, forberede 250 ng af p3s-Cas9 plasmid og 250 ng af sgRNA plasmid for Transfektion, ved hjælp af et lipid-baserede Transfektion reagens. Bland plasmider i 25 μL serum gratis-MEM.
    3. Fortyndes 1 μL Transfektion reagens med 25 μL serum gratis-MEM. Inkuber blanding på RT for 5 min. kombinere de to blandinger og Inkuber den resulterende løsning på RT for 20 min til form plasmid-lipofectamine komplekser.
    4. Efter 20 min af inkubering tilsættes 50 μl opløsning indeholdende plasmid-Transfektion reagens komplekser direkte til hver godt indeholder celler, og bland forsigtigt af vuggende plade frem og tilbage. Inkuber celler ved 37 ° C i en CO2 inkubator for 48-72 h post Transfektion før kørsler for transgen udtryk.

8. beregning af indel frekvenser til at bestemme på mål og off-target aktiviteter

  1. Målrettet dyb sekventering til analyse af på mål og potentielle off target websteder
    1. Isolere genomisk DNA fra trin 6.1.5 eller 7.2.4 med en gDNA forberedelse kit. Generere dyb sekventering biblioteker af PCR-amplifikation af gDNA med primere målretning på mål og off-målet.
    2. Brug indekset primere til at mærke hver enkelt prøve. Underlagt poolede biblioteker parret ende sekventering ved hjælp af en næste generation sequencing maskine.
  2. Dyb sekventering analyse ved hjælp af Cas-Analyzer
    1. Analysere dyb sequencing data ved hjælp af Cas-Analyzer vurdering værktøj17.
    2. Vælg Fastq filerne under fanerne Læs 1 og Læs 2 (Læs 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, Læs 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq).
    3. Udfylde fanen Grundlæggende oplysninger og fanen Analyseparametre . Klik på knappen Send .

Representative Results

Efter Sniper-skærmen er udført, kan procentdelen af overlevelse kolonier beregnes ved at dividere antallet af kolonier på LB-tallerkenen indeholdende chloramphenicol, kanamycin, arabinose og ATC (CKAA) af antallet af kolonier i LB plade indeholdende chloramphenicol og kanamycin kun (CK). Denne procentdel var normalt meget lav, når Sniper-skærmen blev udført med biblioteker af SpCas9. True-positive hits kan blive beriget ved at gentage raster hos den efterlevende pool. I denne repræsentant Sniper-skærmen, for eksempel, blev en 100% overlevelsesrate opnået efter den tredje skærmen (figur 1). Transfections ved hjælp af RNPs eller plasmid-kodede Sniper-Cas9 kan gøres for forskellige mål og den deraf følgende mål og off-target aktiviteter målt ved målrettet amplikon sekventering (figur 2). På de fleste mål, Sniper-Cas9 viser det samme niveau af-målet aktiviteter og højere specificitet nøgletal i forhold til WT. Truncated sgRNAs kan også bruges til yderligere at forbedre specificitet (figur 3). Men deres anvendelse er begrænset til kun et par mål fordi de resulterer i lavt på target aktiviteter i forhold til fuld længde sgRNAs, i de fleste tilfælde. Derfor sgRNAs med varierende længder (fra 17 - til 20-mers) skal afprøves og både på mål og off-target aktiviteter skal måles for at optimere specificitet.

Figure 1
Figur 1: repræsentant Sniper-skærme udført med forskellige biblioteker af tilfældige Cas9 varianter. Mutator bibliotek, EP, og EP bibliotek II angive biblioteker lavet ved hjælp af forskellige kommercielle kits. Første, anden og sidste angiver antallet gange, skærmbilledet berigelse blev udført7. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: på mål og off-target aktiviteter WT-Cas9 eller Sniper-Cas9 parret med en 20-mer guide sekvens leveres via plasmid eller RNP. Specificitet nøgletal blev fastsat ved at dividere målaktiviteten af off-målaktivitet. Fejllinjer angive SEM (n = 3)7. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: på mål og off-target aktiviteter af Sniper-Cas9 i forhold til WT-Cas9 opnået ved hjælp af sgRNAs med varierende længder målretning websteder FANCF01 og AAVS. Specificitet nøgletal blev fastsat ved at dividere indel frekvenser på målwebsteder med dem på de respektive steder, off-målet. sgRNAs med en matchede guanin fra 5' endepunktet (GX18 eller GX19) og dem med en uoverensstemmelse mellem guanin (gX17, gX18, gX19 eller gX20) er angivet. Specificitet nøgletal blev ikke beregnet, da de normaliserede på målet aktiviteter var < 70%7. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

For dem, der ønsker at undgå besværlige screening procedurer for at opnå Sniper-Cas9, er Sniper-Cas9 protein og den kodning plasmid tilgængelige. Ved hjælp af disse materialer, den optimale længde af sgRNA, der giver den højeste specificitet forholdet, bør fastlægges. Desuden anbefales levering af Sniper-Cas9 og sgRNA i en RNP format, fordi det normalt resulterer i en højere specificitet ratio end levering i et plasmid format. I modsætning til Sniper-Cas9 er andre manipuleret Cas9 varianter ikke kompatible med afkortede sgRNAs6,7 eller levering i RNP form8 (med undtagelse af HiFi-Cas9).

For Sniper-skærmen er udvælgelsen af de mismatched sekvens det vigtigste skridt. Udvalg af et uoverensstemmende sgRNA, der er forbundet med lave kavalergang aktivitet mod den indiske regering sekvens bør undgås. Hvis ikke, Cas9 varianter med et WT specificitet vil ikke spaltes E. coli genomisk DNA med forkerte mål-webstedet. Denne effekt vil resultere i et stort antal baggrund kolonier, forringe hele screening procedure.

Da E. coli har en hurtig fordobling tid og høj transformation effektivitet sammenlignet med gær, Sniper-skærmen er fordelagtige i forhold til gær-baseret screening-metoder. Derudover Sniper-skærmen bør være mere følsomme end andre E. coli-baserede systemer, som forkerte stedet udføres på et plasmid: der er en kopi af genomisk DNA og dermed kun en kopi af den forkerte websted i vores system, men et stort antal plasmider inden for en enkelt E. coli celle.

De særlige forhold i andre DNA-endonucleases, der inducerer DSBs, såsom SaCas9 eller Cpf1s, kan også forbedres ved hjælp af Sniper-skærmen. Desværre, Sniper-skærmen kan ikke bruges til at øge specificiteten af base redaktører direkte, fordi base redaktører ikke Fremkald DSBs i genomisk DNA af E. coli. Som base redaktører bruger nickase eller døde version af Cas9 i kernen i deres system, kunne de særlige kendetegn ved base redaktører øges ved hjælp af hits fra snigskytte-skærmen.

Disclosures

ToolGen har indgivet en patentansøgning (PCT/KR2017/006212) der dækker Sniper-skærm (status: ventende, opfinder: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung og Euihwan Jeong er medarbejdere i ToolGen, Inc.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af tilskud fra ministeriet for videnskab og ikt-Korea (2017M3A9B4061406) og National Research Foundation af Korea (NRF) finansieres af den koreanske regering (MSIT) (grant numre 2017M3A9B4061404 og 2018M3A9H3020844) til Jungjoon K. Lee. Plasmid kodning pGRG36 var en gave fra Nancy Craig (Addgene plasmid #16666) og p11-LacY-wtx1 var en gave fra Huimin Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) NEB M0290L
Ampicillin Sodium Salt Fisher Chemical BP1760-25
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma Aldrich 37919 or 94664
Antibiotic Antimycotic solution Welgene LS203-01 Media component
BamHI Enzynomics R003L
Chloramphenicol Sigma Aldrich R4408
Diversify PCR Random Mutagenesis Clontech 630703 Error-prone PCR kit
DNA-Shuffling Kit Jena Bioscience PP-103
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM001-17 Culture media
Endura Electrocompetent Cells (DUO) Lucigen 60242-2 E. coli electrocompetent cells for library preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Welgene S101-01 Media component
Gene Pulser II Bio-Rad E. coli electroporation equipment
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit Agilent 200550 Error-prone PCR kit
genomic DNA prep kit GenAll 106-152 gDNA-prep kit
Glycerol BioShop GLY001.1
GP/MP Cuvette, 0.1cm Bio-Rad BR165-2089 E. coli electroporation equipment
HEK293T cell ATCC CRL-11268 Human cell line
Kanamycin sulfate Acros Organics 450810500
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A3256-25G
LaboPass PCR Purification Kit Cosmogenetech CMR0112
LaboPass Plasmid Mini Cosmogenetech CMP0112 Mini-prep kit
LB Agar Miller Formedium LMM0202
LB Broth Miller Formedium LMM0102
Lipofectamine Invitrogen 11668019 Transfection reagent
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture
Neon Transfection System Thermo MPK5000 RNP Electroporation equipment
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo MPK1096 RNP Electroporation equipment
NucleoBond Xtra Midi EF Macherey-Nagel 740420.50 Midi-prep kit
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 DNA purification kit that enables low-volume elution
Opti-MEM Gibco LS31985070 Transfection media
p11-lacY-wtx1 Addgene #123945
pgrg36 Addgene #16666 E. coli mutator strain
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530L
Pyrophophatase NEB M2403L
Ribonucleotide Solution Set NEB N0450L
RNase inhibitor NEB M0314L
T7 RNA polymerase NEB M0251L
Turbo Dnase Ambion AM2238
XbaI Enzynomics R013L
XL1-Red Competent Cells Agilent 200129

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  2. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  3. Chen, J. S., et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).
  4. Kleinstiver, B. P., et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).
  5. Slaymaker, I. M., et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  6. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  7. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
  8. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  9. Anderson, K. R., et al. CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nature Methods. 15, 512-514 (2018).
  10. Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).
  11. Kulcsar, P. I., et al. Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).
  12. Zhang, D., et al. Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases. Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).
  13. McKenzie, G. J., Craig, N. L. Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC Microbiology. 6, 39 (2006).
  14. Geissmann, Q. OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects. PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).
  15. Chen, Z., Zhao, H. A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases. Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).
  16. Kim, S., et al. CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).
  17. Park, J., et al. Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data. Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).
  18. Studier, F. W., et al. Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes. Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).

Tags

Genetik spørgsmålet 144 Sniper off-målet på mål CRISPR Cas9 RNP plasmid
Ved hjælp af Sniper-Cas9 til at minimere Off target effekter af CRISPR-Cas9 uden tab af målaktiviteten Via styret Evolution
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, J., Jung, M. h., Jeong, E.,… More

Lee, J., Jung, M. h., Jeong, E., Lee, J. K. Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution. J. Vis. Exp. (144), e59202, doi:10.3791/59202 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter