Metodo per ottenere il modello di respirazione nei topi senescenti attraverso Pletimografia Barometrica Sfrenata
Summary
La pletismografia barometrica non vincolata viene utilizzata per quantificare il modello di respirazione nei topi svegli. Mostriamo che 15 segmenti s sotto un protocollo standardizzato visualizzano valori simili a una durata prolungata di respirazione silenziosa. Questa metodologia consente anche la quantificazione di apnea e respiri aumentati durante la prima ora nella camera.
Abstract
La pletismografia barometrica sfrenata (UBP) è un metodo per quantificare il modello di respirazione nei topi, dove la frequenza respiratoria, il volume delle maree e la ventilazione minuti sono regolarmente segnalati. Inoltre, le informazioni possono essere raccolte per quanto riguarda l’uscita neurale della respirazione, compresa l’esistenza di apnee centrali e respiri aumentati. Una considerazione importante per UBP è ottenere un segmento respiratorio con un impatto minimo di comportamenti ansiosi o attivi, per chiarire la risposta alle sfide respiratorie. Qui, presentiamo un protocollo che permette di ottenere linee di base brevi e tranquille in topi invecchiati, paragonabili ad aspettare periodi più lunghi di respirazione tranquilla. L’uso di segmenti di tempo più brevi è prezioso, poiché alcuni ceppi di topi possono essere sempre più eccitabili o ansiosi, e periodi più lunghi di respirazione tranquilla potrebbero non essere raggiunti entro un lasso di tempo ragionevole. Abbiamo collocato topi di 22 mesi in una camera UBP e abbiamo confrontato quattro segmenti di respirazione tranquilla di 15 s tra i minuti 60-120 a un periodo di respirazione tranquillo più lungo di 10 minuti che ha richiesto 2-3 h per l’acquisizione. Abbiamo anche ottenuto conteggi di apnee centrali e respiri aumentati prima dei segmenti di respirazione tranquilla, dopo un periodo di familiarizzazione di 30 minuti. Dimostriamo che 10 min di respirazione tranquilla è paragonabile all’utilizzo di una durata di 15 s molto più breve. Inoltre, il tempo che porta a questi segmenti di respirazione silenziosa di 15 s può essere utilizzato per raccogliere dati riguardanti le apnee di origine centrale. Questo protocollo consente agli investigatori di raccogliere dati di respirazione in un determinato lasso di tempo e rende possibili misure di base silenziose per i topi che possono presentare una maggiore quantità di comportamento eccitabile. La stessa metodologia UBP fornisce un modo utile e non invasivo per raccogliere dati di pattern-of-breathing e consente ai topi di essere testati su diversi punti temporali.
Introduction
UBP è una tecnica comune per la valutazione dei modelli respiratori1,2,3,4. In questo metodo, i topi vengono collocati in una camera chiusa dove le differenze di pressione tra la camera principale (dove l’animale è ospitato) e una camera di riferimento vengono filtrate attraverso uno pneumotacografo per ottenere valori. La configurazione UBP risultante è non invasiva e non vincolata e consente di valutare le misure respiratorie senza la necessità di anestesia o chirurgia. Inoltre, questa tecnica è adatta per studi che richiedono più misurazioni nello stesso mouse nel tempo. Variabili come la frequenza respiratoria, il volume delle maree e la ventilazione minuti possono essere quantificate con questo metodo, durante un singolo studio o in più prove. L’UBP di tutto il corpo fornisce anche misure dei flussi di picco e della durata del ciclo respiratorio. Insieme, questi parametri quantificano il modello di respirazione. Le tracce respiratorie registrate consentono inoltre di esaminare i dati e contare il numero di apnee centrali visualizzate entro un determinato periodo di tempo. Questo conteggio può essere utilizzato insieme ad un’analisi del volume delle maree e dei tempi di inspirazione per misurare altre alterazioni del modello di respirazione.
Sebbene esistano diverse tecniche di pletismografia non invasiva per la valutazione diretta dei parametri fisiologici polmonari, l’UBP per tutto il corpo consente di valutare la funzione respiratoria con uno stress indebito minimo per il topo. Pletismografia a testa in testa, che utilizza misure di flusso midexpiratory di marea ed è anche non invasiva, si basa sulla moderazione, come molti altri tipi di pletismografia (ad esempio, pletismografia a doppia camera). Mentre questi metodi sono stati utilizzati nei modelli di roditori per misurare la reattività delle vie aeree5, l’uso di collari del collo o piccoli tubi di ritenuta può prendere topi (vs. altre specie) più a cclimato e tornare la loro respirazione a livelli di riposo.
Ottenere un segmento ottimale di respirazione dell’aria è una considerazione importante per i confronti di base. L’aumento dell’uso di sistemi di pletismografia disponibili in commercio rende possibile la raccolta di dati di pattern of breathing in molti laboratori. È importante sottolineare che il modello di respirazione è variabile per tutto il periodo di raccolta, in particolare per i topi. Detto questo, è necessario standardizzare l’analisi di base come mezzo per garantire che il livello di formazione degli sperimentatori non confonda i risultati. Ci sono numerosi modi per raccogliere un segmento di respirazione dell’aria, che serve come un’area di variazione tra i disegni sperimentali. Un esempio include la media dell’ultimo 10-30 min di dati che seguono un insieme di tempo definito in precedenza all’interno della camera1, mentre un altro metodo prevede l’attesa fino a quando il mouse è visibilmente calmo per 5-10 min6. Quest’ultimo può richiedere 2-3 h per raggiungere e in alcuni casi, una prova potrebbe essere necessario abbandonare se il mouse non è calmo abbastanza a lungo. Questa preoccupazione è una considerazione particolarmente importante per i ceppi di topi in cui i comportamenti osservati sono più ansiosi ed eccitabili7. Questi topi possono richiedere più tempo per adattarsi all’ambiente della camera e rimanere calmi solo per brevi raffiche di tempo. Limitare il tempo dedicato alla raccolta della linea di base standardizza il tempo della camera per ogni mouse.
È fondamentale che gli sperimentatori ottengano una linea di base adatta che comprenda i valori di comportamento a riposo nel mouse, ma che si verifichino anche in modo tempestivo. Pertanto, l’obiettivo di questo rapporto è fornire una descrizione dei metodi utilizzati per ottenere brevi valori di base silenziosi per la respirazione dei parametri nei topi. Inoltre, riportiamo che le apnee e i respiri aumentati possono essere quantificati durante la prima ora in camera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo fornisce informazioni riguardanti una linea di base di respirazione silenziosa nei topi, oltre a raccogliere dati sulle apnee centrali e sui respiri aumentati. I risultati rappresentativi mostrano che una linea di base tranquilla di 10 min ha un modello di respirazione simile rispetto a una media di quattro s bouts per una coorte di vecchi topi. È importante sottolineare che gli out 15 s non sono statisticamente diversi, né questi gruppi hanno differenze di variazione l’uno dall’altro utilizzando il test …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Angela Le, Sarah Ruby e Marisa Mickey per il loro lavoro di mantenimento delle colonie animali. Questo lavoro è stato finanziato da 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. per sostenere il CNR), e la McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Scienze Naturali (BEE).
Materials
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen – food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
