Método para obter padrão de respiração em camundongos senescentes através de plethysmografia barométrica sem restrições
Summary
A pletimografia barométrica desenfreada é usada para quantificar o padrão de respiração em camundongos acordados. Mostramos que 15 segmentos s sob um protocolo padronizado exibem valores semelhantes a uma longa duração de respiração silenciosa. Essa metodologia também permite a quantificação de apnéia e respiração aumentada durante a primeira hora na câmara.
Abstract
A pletimografia barométrica desenfreada (UBP) é um método para quantificar o padrão de respiração em camundongos, onde a frequência respiratória, o volume das marés e a ventilação minuciosa são rotineiramente relatados. Além disso, informações podem ser coletadas sobre a saída neural da respiração, incluindo a existência de apnéias centrais e respirações aumentadas. Uma consideração importante para a UBP é a obtenção de um segmento respiratório com um impacto mínimo de comportamentos ansiosos ou ativos, para elucidar a resposta aos desafios respiratórios. Aqui, apresentamos um protocolo que permite que linhas de base curtas e silenciosas sejam obtidas em camundongos idosos, comparáveis à espera de crises mais longas de respiração tranquila. O uso de segmentos de tempo mais curtos é valioso, pois algumas cepas de ratos podem ser cada vez mais excitantes ou ansiosas, e períodos mais longos de respiração silenciosa podem não ser alcançados dentro de um prazo razoável. Colocamos ratos de 22 meses em uma câmara ubp e comparamos quatro segmentos de respiração tranquila de 15 s entre os minutos 60-120 para um período de respiração mais longo de 10 minutos que levou de 2 a 3 h para adquirir. Também obtivemos contagem de apnéias centrais e respirações aumentadas antes dos segmentos respiratórios silenciosos, após um período de familiarização de 30 min. Mostramos que 10 min de respiração silenciosa é comparável ao uso de uma duração muito menor de 15 s. Além disso, o tempo que leva a esses 15 segmentos de respiração silenciosa pode ser usado para coletar dados sobre apnéias de origem central. Este protocolo permite que os investigadores coletem dados de padrão de respiração em um período de tempo definido e torna viável medidas de linha de base silenciosas para ratos que podem exibir quantidades aumentadas de comportamento excitável. A própria metodologia da UBP fornece uma maneira útil e não invasiva de coletar dados de padrão de respiração e permite que os camundongos sejam testados ao longo de vários pontos de tempo.
Introduction
UBP é uma técnica comum para a avaliação de padrões respiratórios1,2,3,4. Neste método, os camundongos são colocados em uma câmara fechada onde as diferenças de pressão entre a câmara principal (onde o animal está alojado) e uma câmara de referência são filtradas através de um pneumotacógrafo para obter valores. A configuração resultante da UBP é não invasiva e desenfreada e permite que as medidas respiratórias sejam avaliadas sem a necessidade de anestesia ou cirurgia. Além disso, esta técnica é adequada para estudos que requerem múltiplas medidas no mesmo mouse ao longo do tempo. Variáveis como frequência respiratória, volume de maré e ventilação minuciosa podem ser quantificadas com este método, durante um único ensaio ou em vários ensaios. A UBP de corpo inteiro também fornece medidas de pico de fluxos e duração do ciclo respiratório. Juntos, esses parâmetros quantificam o padrão de respiração. Os traços respiratórios registrados também possibilitam a revisão dos dados e a contagem do número de apnéias centrais exibidas dentro de um determinado período de tempo. Esta contagem pode ser usada juntamente com uma análise do volume das marés e tempos inspiradores para medir outras alterações no padrão de respiração.
Embora existam várias técnicas de pletimografia não invasiva para a avaliação direta dos parâmetros fisiológicos pulmonares, a UBP de corpo inteiro permite uma maneira de testar a função respiratória com o mínimo de estresse indevido ao camundongo. A pletimismografia da cabeça, que utiliza medidas de fluxo midexpiratório de marés e também não invasiva, depende da contenção, como muitos outros tipos de plethysmografia (por exemplo, pletimismografia de câmara dupla). Embora esses métodos tenham sido usados em modelos de roedores para medir a capacidade de resposta das vias aéreas5, o uso de coleiras de pescoço ou pequenos tubos de contenção pode levar os camundongos (vs. outras espécies) mais tempo para se adaptar e retornar sua respiração a níveis de repouso.
A obtenção de um segmento de respiração de ar ideal é uma consideração importante para as comparações de linha de base. O aumento do uso de sistemas de plethysmografia comercialmente disponíveis torna possível a coleta de dados de padrão de respiração em muitos laboratórios. É importante ressaltar que o padrão de respiração é variável durante todo o período de coleta, particularmente para camundongos. Dito isso, é necessário padronizar a análise da linha de base como forma de garantir que o nível de treinamento dos experimentadores não confunda resultados. Existem inúmeras maneiras de coletar um segmento de respiração do ar, servindo como uma área de variação entre projetos experimentais. Um exemplo inclui a média dos 10-30 min finais de dados seguindo um conjunto de tempo previamente definido dentro da câmara1, enquanto outro método envolve esperar até que o mouse esteja visivelmente calmo por 5-10 min6. Este último pode levar de 2 a 3 h para conseguir e, em alguns casos, um julgamento pode precisar ser abandonado se o mouse não estiver calmo por tempo suficiente. Essa preocupação é uma consideração especialmente importante para cepas de camundongos onde os comportamentos observados são mais ansiosos e excitáveis7. Esses ratos podem demorar mais tempo para se adaptar ao ambiente da câmara e permanecer apenas calmos por curtos períodos de tempo. Limitar o tempo dedicado à coleta de linha de base padroniza o tempo de câmara para cada mouse.
É crucial que os experimentadores obtenham uma linha de base adequada que engloba valores de comportamento de repouso no camundongo, mas também ocorre em tempo hábil. Assim, o objetivo deste relatório é fornecer uma descrição dos métodos utilizados para obter valores de linha de base curtos e silenciosos para parâmetros respiratórios em camundongos. Além disso, relatamos que apneias e respirações aumentadas podem ser quantificadas durante a primeira hora na câmara.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo fornece informações sobre uma linha de base respiratória tranquila em camundongos, bem como a coleta de dados sobre apnéias centrais e respirações aumentadas. Os resultados representativos mostram que uma linha de base silenciosa de 10 minutos tem um padrão de respiração semelhante quando comparada a uma média de quatro ataques de 15 s para uma coorte de camundongos antigos. É importante ressaltar que os 15 ataques não são estatisticamente diferentes, nem esses grupos têm diferenças de variaç?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Angela Le, Sarah Ruby e Marisa Mickey por seu trabalho mantendo as colônias de animais. Este trabalho foi financiado por 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. para apoiar a CNR), e pela McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).
Materials
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen – food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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