Summary
억제되지 않은 기압 적당층 은 깨어있는 마우스에서 호흡의 패턴을 정량화하는 데 사용됩니다. 표준화된 프로토콜 아래에 있는 15s 세그먼트는 조용한 호흡의 연장된 기간과 유사한 값을 표시한다는 것을 보여줍니다. 이 방법론은 또한 챔버에서 첫 번째 시간 동안 무호흡증과 증강 호흡의 정량화를 허용합니다.
Abstract
억제되지 않은 기압 적당층 (UBP)은 호흡 빈도, 조수 부피 및 미세 환기가 일상적으로보고되는 마우스에서 호흡 패턴을 정량화하는 방법입니다. 또한 중앙 무호흡증과 보강 호흡의 존재를 포함하여 호흡의 신경 출력에 관한 정보를 수집 할 수 있습니다. UBP를 위한 중요한 고려사항은 호흡 도전에 대한 반응을 해명하기 위하여 불안하거나 활동적인 행동의 최소한의 충격으로 호흡 세그먼트를 얻는 것입니다. 여기에서, 우리는 조용한 호흡의 더 긴 시합을 기다리는 것에 필적하는 나이 든 마우스에서 짧고 조용한 기준선을 장악할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 짧은 시간 세그먼트의 사용은 마우스의 몇몇 긴장이 점점 흥분하거나 불안할 수 있고, 조용한 호흡의 더 긴 기간이 적당한 기간 안에 달성되지 않을 수 있기 때문에, 가치가 있습니다. 우리는 UBP 챔버에 22 개월 된 마우스를 배치하고 취득하는 데 2-3 시간을 했다 더 긴 10 분 조용한 호흡 기간에 분 60-120 사이의 네 개의 15 의 조용한 호흡 세그먼트를 비교했다. 우리는 또한 30 분 숙고 기간에 따라 조용한 호흡 세그먼트 전에 중앙 무호흡증 및 증강 호흡의 수를 얻었습니다. 우리는 조용한 호흡의 10 분이 훨씬 짧은 15 s 의 지속 시간을 사용하는 것과 비슷하다는 것을 보여줍니다. 또한, 이러한 15s의 조용한 호흡 세그먼트에 이르는 시간은 중앙 기원의 무호흡증에 관한 데이터를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 조사자가 일정 시간 내에 호흡 패턴 데이터를 수집할 수 있게 해주며 흥분성 행동의 증가된 양을 나타낼 수 있는 마우스에 대해 조용한 기준선 측정을 실현할 수 있게 합니다. UBP 방법론 자체는 호흡 패턴 데이터를 수집하는 유용하고 비침습적 인 방법을 제공하고 마우스가 여러 시간 지점에 걸쳐 테스트 할 수 있습니다.
Introduction
UBP는 호흡 패턴1,2,2,3,,4의평가를위한 일반적인 기술입니다. 이 방법에서, 마우스는 주 챔버 (동물이 보관되는 곳)와 기준 챔버 사이의 압력 차이가 값을 얻기 위해 기압계를 통해 여과되는 폐쇄 챔버에 배치됩니다. 결과 UBP 설치는 비침습적이고 억제되지 않으며 마취 또는 수술의 필요 없이 호흡 측정을 평가할 수 있습니다. 또한 이 기술은 시간이 지남에 따라 동일한 마우스에서 여러 측정이 필요한 연구에 적합합니다. 호흡 주파수, 조수 부피 및 미세 환기와 같은 변수는 단일 시험 또는 여러 번의 시험을 통해이 방법으로 정량화 될 수 있습니다. 전신 UBP는 또한 피크 흐름과 호흡 주기 기간의 측정을 제공합니다. 이러한 매개 변수는 함께 호흡 패턴을 정량화합니다. 기록된 호흡 추적을 통해 데이터를 검토하고 주어진 기간 내에 표시되는 중앙 무호흡증 수를 계산할 수 있습니다. 이 카운트는 조수 부피 및 흡기 시간의 분석과 함께 호흡 패턴의 다른 변화를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
폐 생리학적 파라미터의 직접적인 평가를 위해 여러 비침습적 과염 기법이 존재하는 반면, 전신 UBP는 마우스에 최소한의 과도한 스트레스로 호흡 기능을 스크리닝하는 방법을 허용한다. 조수 중견 유량 측정을 이용하고 또한 비침범성인 헤드 아웃 과다 모그래피는 다른 많은 유형의 과다 모그래피 (예 : 이중 챔버 과다 모그래피)와 마찬가지로 구속에 의존합니다. 이러한 방법은 기도 응답성을 측정하기 위해 설치류 모델에서 사용되었지만5,목 칼라 또는 작은 구속 튜브의 사용은 적응하고 휴식 수준으로 호흡을 반환하기 위해 마우스 (대 다른 종)를 더 오래 걸릴 수 있습니다.
최적의 공기 호흡 세그먼트를 얻는 것은 기준선 비교를 위한 중요한 고려 사항입니다. 상업적으로 이용 가능한 과다 모그래피 시스템의 사용이 증가함에 따라 많은 실험실에서 호흡 패턴 데이터를 수집할 수 있습니다. 중요한 것은, 호흡의 패턴은 수집 기간 내내, 특히 마우스를 위해 가변적입니다. 즉, 실험자의 교육 수준이 결과를 혼동하지 않도록 하는 수단으로 기준 분석을 표준화할 필요가 있습니다. 공기 호흡 세그먼트를 수집하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 실험 설계 간의 변화의 한 영역역할을 합니다. 한 예로 챔버1내에서 이전에 정의된 시간 집합을 따르는 최종 10-30분의 데이터를 평균화하는 반면, 다른 방법은 마우스가 5-10분6동안눈에 띄게 진정될 때까지 기다리는 것을 포함한다. 후자는 2-3 h를 달성 하기 위해 걸릴 수 있습니다 및 경우에 따라, 마우스가 충분히 오랫동안 진정 되지 않은 경우 재판을 포기 해야 할 수 있습니다. 이 관심사는 관찰된 행동이 더 불안하고 흥분하는 마우스의 긴장에 대한 특히 중요한 고려사항입니다 7. 이 마우스는 챔버 환경에 적응하는 데 더 오래 걸릴 수 있으며 짧은 시간 동안만 침착하게 유지합니다. 기준선 수집에 전념하는 시간을 제한하여 각 마우스의 챔버 시간을 표준화합니다.
실험자는 마우스의 휴식 동작 값을 포괄하는 적절한 기준선을 획득하지만 적시에 발생하는 것이 중요합니다. 따라서, 이 보고서의 목적은 마우스에서 호흡 매개 변수에 대한 짧은 조용한 기준 값을 얻기 위해 사용되는 방법에 대한 설명을 제공하는 것입니다. 또한, 우리는 무호흡증과 증강 호흡이 챔버에서 첫 번째 시간 동안 정량화 될 수 있다고보고합니다.
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Protocol
모든 절차는 르 모인 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 동물의 모든 사용은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설명 된 정책에 동의했다8.
참고: (중요) 실험 전에 동물 사용에 필요한 모든 승인 및 교육을 받으세요. 실험자는 수면, 조난 및/또는 운동 아티팩트대 정상적인 스니핑 및 호흡의 징후를 포함하여 마우스 동작 및 활동 수준에 익숙해지는 것이 중요합니다.
1. 전신 기압 박리 챔버
- 커넥터, O-링 등을 포함한 기압 적도 측정 챔버에 대한 적절한 사용자 매뉴얼을 읽고 분석기(예: 대사) 및 소프트웨어에 특정한 파라미터를 정의하는 표준 프로토콜 파일을 만듭니다.
- 모든 호스와 튜브가 챔버에 연결되어 있는지 확인하십시오. 기체 흐름 튜브(플로우인)와 진공 관(플로우 아웃)을 기압 간투 챔버에 직접 연결합니다.
참고: 유입은 표시된 바이어스흐름개구에 부착되어야 합니다. - CO2,O2및 N2 가스 탱크를 가스 믹서에 부착합니다. 실험 전에 모든 가스 탱크가 열린 위치에 있는지 확인하십시오.
2. 기압 변두리 챔버의 교정
- 기압 플티스모그래피 소프트웨어의 하드웨어 탭에서 7700 증폭기 설정을 선택하여 높고 낮은 가스 흐름을 보정합니다.
- 실험 설계 및 가스 분석기(~0.1L/min)에 적합한 진공(챔버 에서 유동)을 설정합니다.
참고: 유출 속도는 교정 및 정확한 대사 기록을 위한 실험 전반에 걸쳐 동일하게 유지되어야 합니다. - 챔버에서 유동관을 제거하고 진공을 끄고 공기의 낮은 흐름을 설정합니다.
- 해당 챔버의 로우 유닛 셀에 0을 입력하여 0 흐름을 기록합니다. 낮은 Cal 셀을 두 번 클릭하고 시간을 3초로 변경하고 측정값을누르고 있습니다.
- 유량튜브를 재부착하고 가스(20.93%O2,밸런스N2)가가스 믹서로부터 기압 적도 챔버를 통해 흐르도록 한다.
- 리터/분에서 유입을 밀리리터/초로 변환합니다. 해당 챔버에 대한 하이 유닛 셀을 클릭하고 밀리리터/초단위로 값을 입력합니다. High Cal을두 번 클릭하고 시간을 3초로 변경하고 측정값을클릭합니다.
- 7700-증폭기 설치 탭을 열어 놓고 대사 분석기를 기압 간편화 소프트웨어로 교정합니다.
3. 신진 대사 분석기 교정
- 가스 믹서 프로그램에서, 가스 믹서가 20.93%O2 및 79.07%N2를함유하는 가스의 흐름을 방출하도록 설정한다.
- 대사 분석기에서O2 교정 수준을 20.93%로 설정하고CO2를 0%로 읽습니다. 적절한 값을 입력하면 다이얼을 다시 샘플로 돌립니다.
- 높은 O2 백분율을 설정합니다. 기압 과다 모그래피 소프트웨어의 ABCD-4 탭을 클릭한 다음 C2 라인의 하이 유닛 아래에 20.93을 입력합니다. 하이 칼에서,3 s로 시간을 변경하고 측정을명중 .
- 낮은 CO2 백분율을 설정합니다. C3 선의 낮은 Cal 아래에 0을 입력한 다음 시간을 3초로 변경하고 Low Cal에서 측정값을 클릭합니다.
- 가스 믹서 프로그램에서O2 값을 10%로 변경하고CO2 값을 5%로 변경합니다. 가스 흐름이 이러한 값에 맞게 조정될 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 대사 분석기에서 조정 노브를 돌려CO2를 5%로 교정합니다. 값이 보정되면 다이얼을 다시 샘플로 돌려야 합니다.
- 높은 CO2 백분율을 설정합니다. 기압 과다 모그래피 소프트웨어에O2 및CO2에 적절한 값을 삽입하기 전에 분석기 판독값이 안정적인지 확인합니다. C3 아래에서 높은 단위를 클릭하고 5를입력합니다. 3s로 높은 칼을 변경하고 측정을명중 .
- 낮은 O2 백분율을 설정합니다. C2 옵션 아래에서 낮은 단위를 클릭하고 10을입력합니다. 낮은 Cal, 입력 3초를 클릭하고 측정을클릭합니다.
- 가스 믹서의 가스 값을 다시 20.93% O2 및 79.07% N2로변경합니다. 챔버가 이러한 값에 적응할 때까지 몇 분 간 기다립니다. 대사 분석기에서 자동으로 20.93% O2 및 0%CO2를읽지 않는 경우 3.1\u20123.7 단계를 반복하여 적절한 교정을 보장합니다. 인증 된 가스 탱크로 적절한 교정을 정기적으로 확인하십시오.
- 기압 과다 모그래피 챔버에 연결된 유량계를 다시 확인합니다. 실험에 적합한 속도로 챔버 안팎으로의 공기 흐름을 조정합니다(일반적으로 0.1-0.3 L/min).
- 모든 설정이 기압 변액 조영 소프트웨어에 적용되면 확인을 클릭하여 녹화를 시작합니다.
4. 억제되지 않은 기압 적 개술
- 마우스의 무게와 초기 체온을 기록합니다. 빈 챔버에서 O2 및CO2 데이터를 수집하기 위해 챔버에 마우스를 배치하기 전에 10 분 기다립니다. 잡음과 냄새가 데이터 수집을 방해하지 않도록 마우스에 익숙한 조용한 지역에서 작업하십시오. 데이터 수집실에서 출입하는 문이나 직원의 개폐를 포함하여 가능한 중단을 방지합니다.
참고: 이 특정 프로토콜은 22 개월 된 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용했습니다. - 첫 번째 시간 동안 마우스의 동작을 문서화하고 챔버에서 유입/나가는 흐름의 특정 값을 포함하여 자세한 메모를 작성합니다.
- 챔버 습관의 60 분 후, 다음 60 분 동안 조용한 호흡의 세그먼트에 대한 시계. 스니핑과 그루밍없이 길이가 적어도 15 s 를 지속하는 세그먼트를나열합니다. 이식형 장치를 사용할 때는 10분마다 체온 을 측정하십시오.
- 실험이 끝나면 챔버에서 마우스를 제거하고 케이지에 다시 놓습니다. 모든 장비를 청소하고 철저히 닦아야합니다. 물방울이 남아 있으면 가압 공기를 사용하여 제거하십시오.
5. 호흡과 신진 대사의 패턴분석
- 기압 plethysmography 검토 파일을 열고 관심있는 동물에 대한 기록 된 노트를 참조하십시오.
- 소프트웨어에서 대사 패널을 열고 챔버가 비어 있을 때O2 및 CO2의처음 10분의 평균을 취합니다. 이러한 값을 FiO2 및 FiCO2로기록합니다.
- 기압 과식 소프트웨어의 흐름 패널을 봅니다. 특성 분석을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 적절한 매개 변수를 설정합니다. 메타 1 탭에서 5.2 단계에서 FiO2 및 FiCO2를 입력하고 메타 2아래의 챔버로의 흐름을 입력하여 VO2 및 VCO2를계산합니다.
- 호흡 분석 패턴의 경우, 유동 패널 추적뿐만 아니라 동물 행동에 대한 메모를 사용하여 15초 동안의 조용한 호흡 시간을 확인합니다. 데이터 파서 탭에서 열린 데이터 파서 대화에서 15초 간격의 조용한 Parser View Mode 호흡 시간을 입력합니다.
- 구문 분석 된 파생 된 데이터 저장을 클릭합니다. 스프레드시트에서 데이터 파일을 열어 binned 데이터를 가져옵니다.
6. 무호흡증 및 증강 호흡 분석
- 열려 있는 검토 파일에서 파서 뷰 모드를종료합니다. 설정 및 P3 설정에서 그래프 설정 옵션으로 이동하여 유형에서 페이지 보기를 선택합니다. 창 수에 대해 5를 선택합니다. -2를 낮음으로 표시된 상자에 넣고 2를 0리터/초의 유량 측정을 위해 높음으로 표시된 상자에 넣습니다. 변경 내용을 적용합니다.
- 흐름 추적 패널에서 30분 표시로 스크롤합니다.
- 마우스를 챔버에 배치 한 후 30-60 분 동안 무호흡증 과 증강 호흡을 계산합니다. 무호흡증을 나타내는 0.5 s보다 오래 지속되거나 같은 호흡 기간을 정량화합니다. 증강 호흡은 1.25 mL /s 이상의 호흡 흔적의 급격한 상승과 -0.75 mL / s 이하의 급격한 감소로 표시됩니다.
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Representative Results
UBP의 결과는 정상 공기 가스 하에서 수행된 16세(22개월 된) 마우스에서 호흡 패턴의 평가로서(균형 잡힌N2를가진 20.93%O2)가 보고되었다. 분석은 먼저 4개의 짧은 15s 세그먼트의 평균 대 더 긴 10 분 조용한 호흡 세그먼트 (2 시간 이상 을 얻었다)의 비교를 포함했습니다 (분 60-120 안에 정량화). 호흡이 활발한 호흡 동작없이 일치하는 조용한 호흡의 대표적인 흐름 추적은 그림 1A에제공됩니다. 유사한 추적이 동물에게서 수집될 때, 호흡의 100%는 소프트웨어에 의해 받아들여져야 합니다. 그러나 그림 1B는 마우스가 챔버를 탐색하고, 스니핑 및/또는 그루밍하는 보다 활동적인 세그먼트에서 호흡을 나타냅니다. 그림 1B에 표시된 것과 유사한 추적은 소프트웨어에서 받아들일 가능성이 적으며 이 방법론에서 사용하고 설명하는 호흡 컬렉션 유형에는 적합하지 않습니다. 두 시간 점 사이의 가능한 호흡 패턴 차이의 평가를 위해 선택된 파라미터는 호흡주파수(도 2A),조수부피(VT, 도 2B),미세 환기 (VE, 도 2C),조수 부피 / 흡기 시간 비율 (VT / Ti, 도 2D),및 미세 환기 / 추방 이산화탄소 비율 (VE / VCO2/ g, 도 2E),이는 모두 기압 적설 소프트웨어 및 Drorbaugh 및 Fenn 방정식을 사용하여 계산하였다. 이러한 측정값에 대해 보고된 값은 마우스 모델6,,9에대해 이전에 보고한 값의 범위 내에 있습니다. 그룹 간에 는 유의한 차이가 없습니다. 호흡 주파수와 VT 데이터의 다중 비교에 대한 사후 교정은 본페로니(p< 0.025)로 고려되었다.p 이러한 결과는 15s 기준선을 사용하여 단순화된 프로토콜을 사용하면 더 긴 기준 프로토콜과 유사한 결과를 제공한다는 것을 보여줍니다.
추가 분석은 주파수, VT, VE, VT/Ti, 및 VE/VCO 2/g에 대한24개의 15s 기준선 세그먼트각각에 대해 수행하였다(도3). 시간 포인트p 간에 유의한 차이(p> 0.05)가 발견되지 않았습니다. 또한 호흡 패턴 측정에 대한 4개의 시간 세그먼트 중 어느 값의 가변성도 없었다. 또한 15s 그룹 과 10분 그룹의 세그먼트의 가변성을 테스트하고 평균 그룹 데이터를 비교할 때 Levene의 테스트를 사용하여 유의한 차이를 발견하지 못했습니다.
UBP 프로토콜의 분 30-60 동안 각 동물에 대해 관찰 된 무호흡증 및 증강 호흡의 수는 도 4에제시된다. 이 결과는 나이 든 동물이 무호흡증의 높은 수와 30 분 범위 안에 증강 호흡의 존재를 전시한다는 것을 보여줍니다 (그림 1C에표시된 추적). 데이터는 노화 과정 도중 변경을, 이 사실 인정이 22 달 생쥐에서 관찰되었기 때문에, 표시합니다. 무호흡증 및 증강 호흡 분석에 대한 인터터 신뢰성을 확인하기 위해 Pearson 상관 관계는 두 개의 다른 조사자에 대해 계산되었습니다. 증액자 간의 높은 수준의 합의가 발견되었으며, 증강 호흡에 대한 무호흡증 및 r = .86의 값으로 표시되었다. 미래 연구에서, 대조군에 비해 무호흡증의 증가 수는 신경 구성 요소에서 유래 호흡 기능 장애의 이야기 것.
그림 1: 대표 흐름 추적. (A)마우스가 스니핑이나 그루밍과 같은 활성 동작을 표시하지 않는 조용한 기준선에서 흐름 추적. (B)활성 호흡 기간에서 흐름 추적우리의 분석에 포함되지, 마우스는 챔버에 대해 이동하고 많은 호흡은 일상적으로 허용되지 않는 곳. (C)무호흡의 기간 뒤에 증강 호흡을 표시하는 흐름 추적. 모든 추적에 대해 5s 창이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 호흡 매개 변수는 22 개월 된 마우스에서 10 분 및 15 s의 진정 호흡 세그먼트와 유사합니다. 기압 과염 모그래피는 숙성 된 마우스에서 호흡 데이터를 수집하는 데 사용되었습니다(n = 16, 22 개월). 호흡 데이터는 두 개의 상이한 시간 포인트 동안 마우스에 대해 계산되었다, 즉 챔버에있는 마우스의 60-120 분 마크 내에서 4 의 평균 15 s의 진정 간격과 일관된 진정 호흡의 10 분. (A)호흡 빈도(호흡/분) (B)조수 부피 (VT; 밀리리터 / 호흡). (C)분 환기 (VE; 밀리리터 / 분). (D)조력량과 인에이션 시간(VT/Ti; 밀리리터/초)의 비율입니다. (E)이산화탄소 배출에 대한 분 환기의 비율, 중량에 정규화 (VE / VCO2/ g). 사후 수정 후 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이가 없습니다(p > 0.025). 평균 이상의 >3 SD 값은 이상값으로 간주되어 데이터 세트에서 제거되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.
그림 3: 4 개의 15 s 간격 비교. 호흡 데이터는 챔버 배치의n 60-120 분 이내4개의 분리된 15 s 간격을 위한 진정 호흡 마우스(n=16, 22개월)에서 계산되었다. (A)호흡 빈도(호흡/분) (B)조수 부피 (VT; 밀리리터 / 호흡). (C)분 환기 (VE; 밀리리터 / 분). (D)조력량과 인에이션 시간(VT/Ti; 밀리리터/초)의 비율입니다. (E)이산화탄소 배출에 대한 분 환기의 비율, 중량에 정규화 (VE / VCO2/ g). 시간세그먼트(p> 0.05) 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없습니다. 이상값은 평균 보다 높은 >3 SD로 정의되고 제거됩니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.
그림 4: 생쥐의 무호흡증 및 증액 호흡 카운트. 무호흡증 (호흡하지 않고 ≥0.5 s) 및 증강 호흡 (ABs; 1.25 mL /s 이상 흡입의 급격한 증가 -0.75 mL/s 이하의 급격한 호기 후 30-60 분 사이 세 된 마우스(n = 16, 22 개월)에서 계산되었다. 카운트는 30 분 이상 분석되었고 그 기간 동안의 합계가 보고됩니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.
그림 5: 억제되지 않은 기압 적당도 (UBP) 설정의 회로도. 전체 UBP 설정은 그림에 설명된 것과 유사해야 합니다. 챔버로 들어오고 나가는 가스에 대해 유동 측정을 측정해야 하며, 가스 조성은 데이터 해석을 위해 알려져 있어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜은 마우스의 조용한 호흡 기준선에 관한 정보를 제공뿐만 아니라 중앙 무호흡증과 증강 호흡에 대한 데이터를 수집합니다. 대표적인 결과는 10분 의 조용한 기준선이 오래된 마우스의 코호트에 대한 4개의 15s 시합의 평균에 비교될 때 호흡의 유사한 패턴을 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 중요한 것은, 15s 시합은 통계적으로 다르지 않으며, 이 단은 Levene의 시험을 사용하여 서로 에 있는 변이가 없습니다. 이 데이터는 단 한 번의 짧은 시합이라도 조용한 호흡을 모니터링하기에 충분하다는 것을 보여줍니다. 그러나, 10 분 시합은 최소한의 스니핑과 그루밍 활동을 포함 할 수 있기 때문에, 15 s 대 10 분에서 마우스 내의 개별 적인 변이를 분석하는 것은 다른 사실 인정귀착될 수 있다는 것을 전적으로 가능합니다. 그러나 개별 마우스 기준선 세그먼트를 비교하기 위해 Levene의 테스트를 사용하면 이 프로토콜에 설명된 것과 는 다른 분석을 제공합니다. 전반적으로, 이 방법론의 디자인은 조용한 기준선의 더 긴 기간을 달성하기 위해 각 마우스를 기다릴 필요 대, 챔버에서 분 60-120 동안 획득 할 수있는 15 s 호흡 세그먼트를 사용합니다.
기준선에 필요한 짧은 기간은 조용한 호흡을 위해 시험될 마우스의 더 염려하는/교반한 긴장을 허용합니다. 더 긴 호흡 세그먼트 (즉, 10 또는 2 분)의 사용은 마우스가 3 시간 안에 조용한 호흡 흔적을 표시하지 않는 경우에 시험을 포기해야 할 수 있는 지점까지 프로토콜 기간을 길게 합니다. 많은 실험 설계에는 호흡 기 문제(즉, 저산소증)가 포함되기 때문에 다른 가스에 할당된 연장된 시간은 기준선 수집 시간이 표준화되어야 할 필요성을 강조합니다. 조용한 호흡의 단 하나 15 s bout의 사용은 약실에서 특히 흥분될 지도 모르다 마우스 (그리고 마우스의 긴장)와 함께 일의 염려를 완화하는 것을 돕습니다. 기압 과염 으로 작업 하는 동안, 우리는 발견 ~10% 연구 당 쥐의 작은 수행 하는 그들의 무 능력 때문에 제외 했다 2 챔버 내에서 지속적인 조용한 호흡의 분. 이전 친숙한 시험의 구현은 실험당일 챔버에 놓일 때 마우스가 더 빨리 진정시키는 데 실패했습니다. 그러나, 마우스의 균주, 성별 및 연령이 모두 챔버 환경10,,11에다르게 반응할 수 있기 때문에, 일부 코호트에 대해 습관화 기술이12,,13에 도움이 될 수 있다. 우리의 친숙한 시험은 실험 전에 며칠 동안 1-2 시간 동안 시험실에 UBP 챔버에 마우스를 두는 것으로 구성되었습니다. 우리는이 절차 다음 동물 행동에 변화를 관찰 하는 동안, 이전 연구 는 24 습관의 시간 쥐에서 자발적인 신체 활동의 결과로 참신 한 효과 제거 하는 데 필요한 것으로 나타났습니다12. 부가적으로, Kabir 외. 홈 케이지에 기압 과다 조영챔버와 유사한 크기의 플라스틱 실린더를 배치하는 것이 실험13전에 설정에 익숙해쥐를 얻는 데 유리하다는 것을 것을을 발견했다.
이 프로토콜은 또한 신경 통제 문제점을 나타내는 중앙 무호흡증의 정량화를 통해 마우스에 있는 가능한 호흡 기능 장애를 밝힙습니다. 기준선 호흡 패턴-호흡 의 수집 이전에 관찰30분은 모든 16세 마우스가 높은 수의 무호흡 에피소드 및 증강 호흡을 나타냈다는 것을 보여주었다(도 1C에서나타남). 이 나이 든 마우스 코호트에 있는 수많은 무호흡증은 실험에 추가 시간을 추가하지 않고 또 다른 중요한 호흡 측정을 정량화하는 이 프로토콜의 기능을 강조합니다. 나이와 질병 진행 (해당되는 경우)이 무호흡 증 에피소드의 존재와 수에 영향을 줄 수 있음을 주목해야합니다.
조용한 호흡을 특성화하기 위해서는 프로토콜의 지속 기간 동안 기압 과다 모그래피 챔버 및 마우스를 지속적으로 관찰하는 것이 중요합니다. 조용한 호흡의 정량화를 위해 마우스는 깨어 있어야하지만 스니핑, 그루밍 또는 탐색과 같은 활성 행동에 참여하지 않아야합니다 (그림 1A에표시). 수면 중 호흡 패턴은 깨어있는 동물14,,15에서와다를 수 있기 때문에 깨어있는 상태에서 진정 호흡의 수집이 중요합니다. 그것은 조용한 호흡의 긴 세그먼트 수 면의 기간을 포함 될 수 있습니다., 실험 디자인에 따라 원하는 되지 않을 수 있습니다. 이 경우, 조용한 호흡의 짧은 세그먼트는 활성 세그먼트가 짧은 (15 초) 조용한 호흡 세그먼트 측면 때 수면 중 데이터 수집의 가능성이 감소로, 문서화하는 것이 이상적 일 것이다. 우리는 조용한 호흡의 더 긴 세그먼트가 쥐의 그것에 비해 아주 다른 것처럼 보이 방에서 마우스 행동으로, 마우스 모형에서 취득하는 도전이 될 수 있다는 것을 관찰했습니다. 적절한 호흡 세그먼트에 대한 마우스 호흡 흐름을 비판적으로 관찰하고 동물 행동을 문서화하는 것이 중요합니다. 환기가 감소되거나 호흡이 불안정한 경우이 방법을 여전히 활용할 수 있습니다. 이러한 경우, 15s 세그먼트를 선택할 때 실험자가 코호트에 눈을 멀게 하는 것이 필수적이다. 소프트웨어 프로그램은 15 s 기간 동안 100 %의 수용률로 호흡을 구별해야합니다. 우리는 정지된 마우스가 아직도 염려할 지도 모르기 때문에 동물이 기준선에 대한 행동 기준을 충족한다는 것을 확인하는 것 이외에 호흡 추적의 주의를 취하는 것이 좋습니다. 이전 연구는 쥐가 진정 행동을 보였지만, 그들은 여전히 테스트 룸 내에서 제어 자극에 대한 응답으로 변경 된 호흡 패턴을 보여 주었다 (즉, 증가주파수)를보고 13.
주파수, VT, VE, 흡기 및 유통 시간 및 VE/VCO2의 측정값은 모두 분석기및 UBP 소프트웨어를 사용하여 정량화되며 문헌에 자주 보고됩니다. 특히 VT 및 VE 계산은 체온, 주변 챔버 온도, 습도 및 기압에 대해 알려진 값을 요구하는 Drorbaugh 및 Fenn 방정식16을사용합니다. 가장 정확한 VT 및 VE 값에 대해 실험 전반에 걸쳐 이러한 측정값을 수집하는 것이 좋습니다. 시스템에서 계산하는 다른 변수는 주의해서 사용해야 합니다. UBP는 폐 역학의 직접적인 측정이 아닙니다; 따라서 기도 저항과 관련된 변수(예: 향상된 일시 정지 [Penh])를 염두에 두고 이 주의 사항으로 해석되어야합니다 5. 소프트웨어에 의해 계산된 변수에 영향을 미칠 수 있는 UBP 설정의 추가 구성 요소에는 유량 및 시스템의 일반적인 교정이 포함됩니다. 씰과 개스킷이 제대로 작동하는지 확인하고(누출 없음) 모든 장비를 기압 과다 모그래피 챔버에 적절하게 연결합니다(그림5). 챔버 안팎의 유량은 일관되게 유지되어야 합니다. 필요한 유량은 UBP 설정마다 다를 수 있으므로 실험 전에 이러한 값을 확인하는 것이 중요합니다. 챔버내의 유량은 신선한 공기 또는 가스 문제를 적시에 제공하기에 충분해야 합니다. 유량은 또한 대사 분석기들이 호흡의 변화 패턴의 위험을 제기하는 챔버 환경 내에서CO2가 축적되지 않고 O2및 CO2를 측정할 수 있도록 충분해야 한다. 마찬가지로, 가스 믹서/분석기 교정은 대사 파라미터가 정확하게 측정되도록 정기적으로 구현되어야 합니다.
의식적인 UBP를 위한 그밖 고려사항은 동물이 시험되는 동안 실험실 내의 산만함을 감소시키는 것을 포함합니다. 시끄러운 소음, 다른 냄새, 그리고 방에 있는 불필요한 인원의 존재는 모두 마우스에 의해 전시된 불안한 행동에 추가할 수 있습니다. 테스트 영역으로 작은 방을 사용하는 것이 도움이 될 수 있지만, 이것이 가능하지 않은 경우, 골판지 벽 (작은 보기 창) 마우스에 대한 산만을 완화하기 위해 챔버를 둘러싸는 설정할 수 있습니다. 기압 과다 모그래피 추적 내에서 추가 소음을 방지하기 위해 실내 전기 활동은 최소한으로 유지되어야한다. 따라서 소프트웨어가 빈 챔버에서 데이터를 수집하는 10분 동안의 흐름 추적을 기록하는 것이 중요합니다. 이러한 추적은 평평하게 유지되어야 하며 중단이나 약간의 파도는 소음의 징후이며 해결해야 합니다. 도어 개폐 또는 HVAC 작동으로 인한 압력 변화는 잘못된 변동을 가중시킬 수 있으며 이러한 작업이 최소한으로 발생하도록 보장하는 것이 중요합니다(그리고 이러한 동작이 발생할 때 이를 지적하는 것). 습도는 계산된 조수량과 미세 환기에도 영향을 줄 수 있으므로 사용 전에 챔버와 연결 튜브가 건조되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 필요한 경우, 흐름-인 튜브와 순서대로 건조기 비드의 사용은 챔버 입구 전에 공기의 모든 응축을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 단계는 습도가 동물의 관리 및 사용을위한 가이드8 (30 %-70 %, 이상적으로 설정점의 10 % 이내)에 나열된 수준보다 일상적으로 높은 경우 제정 될 것입니다. 습도는 또한 동물의 존재로 인해 챔버에 축적 될 수 있습니다. 일부 습도는 정상이지만, 동물이 과도하게 활성화되거나 더 긴 기간 동안 챔버에 놓이면 계속 빌드될 수 있습니다. 습도 수준이 최대 수준(99.99%)에 도달하면 유사한 호흡 측정값을 유지하기 위해 실험 중에 챔버를 열고 닦아야 할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 기압, 주변 온도, 동물 온도 및 습도의 변화를 설명합니다. 가장 좋은 방법은 "사과에 사과"연령, 균주 및 성별에 걸쳐 비교되고 있도록 합리적인 범위 내에서 값을 유지하는 것입니다. 더욱이, 마우스의 circadian 주기 및 시험의 시간 범위, 뿐만 아니라 방의 특정 조명 조건은,13,,17을고려하는 중요한 세부 사항이다. 예를 들어, 우리는 일반적으로 그들의 하우징 룸 (빛 또는 어두운 주기) 및 3 h 범위18내의 유사한 조명에서 마우스를 테스트합니다. 실험자는 또한 기준선 선택의 차이를 방지하기 위해 데이터 수집 및 분석 중에 동물 그룹에 눈을 멀게 해야 합니다. 가능하면 동일한 실험자는 주어진 실험에서 모든 데이터를 수집하거나 모든 추적을 분석해야 합니다. 실험자가 동물 집단에 눈을 멀게 하는 단계뿐만 아니라 하루 중 비슷한 시기에 무작위화 및 테스트하는 단계는 조사의 엄격함에 매우 중요합니다. 궁극적으로 흐름 추적을 변경할 수 있는 불필요한 요인이 있으며 UBP를 수행할 때 이러한 문제를 고려해야 합니다.
UBP 방법은 마우스에서 호흡의 패턴을 특성화하는 데 사용되는 기술이다. 기준선 측정값은 15s 호흡 세그먼트를 사용할 때 2시간 이내에 수집될 수 있습니다. 여기에서 우리는 더 젊은 마우스 보다는 수시로 더 동요되는 나이 든 마우스로, 그밖 불안하거나 액티브한 마우스 긴장이 또한 이 프로토콜로 시험될 수 있었다는 것을 건의하는 나이 든 마우스로 행해질 수 있는 방법을 보고합니다. UBP에서 수집된 데이터는 비침습적이며 여러 시간 동안 테스트할 수 있으므로 노화, 약물 치료 및 질병 진행에 대한 연구에 유용합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자들은 안젤라 르, 사라 루비, 마리사 미키가 동물 식민지를 유지하는 일에 대해 감사를 표하고 싶습니다. 이 작품은 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (CNR을 지원하는 L.R.D.) 및 자연 과학의 McDevitt 학부 연구 펠로우십 (BEE)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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