Summary
在这里,我们提出了基于Cas9的外显23删除协议,从Dmdmdx小鼠衍生的皮肤成纤维细胞恢复iPSC中的营养不良素表达,并使用Tet-on MyoD激活系统将iPSC直接分化为肌源性祖细胞(MPC)。
Abstract
Duchenne 肌肉营养不良症 (DMD) 是一种由肌营养不良基因突变引起的严重渐进性肌肉疾病,最终导致肌肉祖细胞衰竭。聚类定期间隔短血循环重复/CRISPR相关9(CRISPR/Cas9)基因编辑有可能恢复肌营养不良素基因的表达。自体诱导多能干细胞(iPSCs)衍生的肌肉祖细胞(MPC)可以补充干细胞/祖细胞池,修复损伤,防止DMD的进一步并发症,而不会引起免疫反应。在这项研究中,我们介绍了CRISPR/Cas9和非集成iPSC技术的组合,以获得肌祖具有恢复的营养不良蛋白表达。简单地说,我们使用非集成仙台载体从Dmdmdx小鼠的皮成纤维细胞中建立iPSC线。然后,我们使用CRISPR/Cas9删除策略,通过重新框住的营养不良基因的非同源端联接来恢复肌营养不良症表达。在PCR验证了94个精选iPSC菌落的三个菌落的外显酶消耗后,通过多氧环素(Dox)诱导的肌D表达将iPSC分化为MPC,这是一种关键转录因子,在调节肌肉分化方面起着重要作用。我们的结果表明,使用CRISPR/Cas9删除策略在iPSC衍生的MPC中恢复营养不良素表达的可行性,这为开发未来治疗DMD的疗法具有巨大潜力。
Introduction
杜氏肌营养不良症 (DMD) 是最常见的肌肉营养不良症之一,其特征是缺乏营养不良症,影响全球约 5,000 名新生儿中的 1 个 。肌营养不良基因功能的丧失导致结构肌肉缺陷,导致渐进性肌纤维退化1,2。重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因治疗系统已经过测试,以恢复肌营养不良症的表达和改善肌肉功能,例如使用微营养不良症(μ-Dys)替换基因。然而,rAAV方法需要反复注射来维持功能蛋白3,4的表达。因此,我们需要一种策略,能够有效和永久地恢复DMD患者的营养不良症基因表达。Dmdmdx小鼠是 DMD 的小鼠模型,在肌营养不良素基因的外显子 23 中具有点突变,该基因引入过早终止通香,导致缺乏 C-端营养不良症结合域的非功能性截断蛋白。最近的研究表明,使用CRISPR/Cas9技术,通过精确的基因校正或突变外源删除在大小动物5,6,7恢复营养不良蛋白基因表达。Long等人8报告了通过同源定向修复(HDR)基于CRISPR/Cas9基因组编辑来纠正Dmdmdx小鼠生殖系中营养不良蛋白基因突变的方法。El Refaey等人9日报告说,rAAV可以有效地切除营养不良小鼠体内的突变外生23。在这些研究中,gRNA被设计在20和23的内源中,导致双链DNA断裂,通过非同源端连接(NHEJ)修复DNA后部分恢复肌营养不良症表达。更令人兴奋的是,Amoasii等人10最近报告了rAAV介导CRISPR基因编辑在恢复犬型肌营养不良蛋白表达的疗效和可行性,这是未来临床应用的重要一步。
DMD也导致干细胞紊乱11。对于肌肉损伤,住宅肌肉干细胞补充肌肉分化后死亡的肌肉细胞。然而,连续的损伤和修复周期导致肌肉干细胞12端粒缩短,干细胞池过早耗尽13,14。因此,将自体干细胞治疗与基因组编辑相结合,以恢复营养不良素表达,是治疗DMD的实用方法。CRISPR/Cas9 技术提供了产生自体基因校正诱导多能干细胞 (iPSC) 的可能性,用于功能性肌肉再生,并在不引起免疫排斥的情况下防止 DMD 的进一步并发症。然而,iPSCs有肿瘤形成的风险,可以通过iPSC分化为肌原祖细胞来缓解。
在此协议中,我们描述了使用非集成仙台病毒将Dmdx小鼠的皮肤成纤维细胞重新编程到iPSC中,然后通过CRISPR/Cas9基因组删除恢复肌营养不良素表达。通过基因分型验证iPSC中的Exon23缺失后,通过MyoD诱导的肌基分化,将基因组校正的iPSC分化为肌原原体(MPC)。
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Protocol
所有动物处理和外科手术均由奥古斯塔大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行。老鼠被喂食标准饮食和水。
1. 从成年Dmdmdx小鼠中分离原虫成纤维细胞
- 根据奥古斯塔大学佐治亚医学院批准的IACUC,通过CO2窒息和胸腔切除术,将成年Dmdx小鼠(雄性,2个月大)安乐死。在层罩下无菌条件下,用无菌手术刀切割尾部。用70%乙醇冲洗尾巴5分钟,然后在6厘米的盘子中用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。
- 沿着尾部皮肤从底座到尾尖的尖尖,用钳子轻轻剥去尾部皮肤。使用无菌手术刀将皮肤切碎至 1 mm3,并将切碎的皮肤组织移动到 Dulbeco 的最小必需介质/Ham 的 F12 (DMEM/F12) 中 6 厘米的培养皿中,含有 0.1% 胶原酶 IV 和 1 U/mL 的消泡剂。
- 在5%的CO2培养箱中,在37°C下在培养皿中消化皮肤组织2小时。
- 涂有纤维蛋白和0.2%明胶的6孔板(199 mL的纤维蛋白为1 mL,含0.2%明胶);材料表)并在37°C孵育1小时。
- 用1 mL移液头分离消化的皮肤组织,并将组织和上清液转移到无菌的15 mL圆锥形离心管中。在室温下以217 x g离心3分钟,丢弃上清液,将颗粒重新悬浮在1.5 mL的成纤维细胞介质(材料表)中。
- 培养颗粒,包括步骤1.5的不完全消化皮肤组织,在6孔板涂上纤维素,在37°C,5%CO2培养箱中从步骤1.4培养0.2%明胶。在初始电镀后24小时更换介质以去除未连接的细胞,并每48小时更换一次介质。
2. 将小鼠皮肤成纤维细胞重新编程到 iPSC 中
- 转导前两天,在37°C培养箱中,用细胞分离溶液(材料表)从步骤1.6中消化小鼠皮下成纤维细胞,在5%CO2的加湿气氛下,5分钟。
- 使用血球计和离心机在217 x g下计数细胞3分钟。
- 每孔密度为1⁄2 x 105的粒细胞在6孔板和培养物,在37°C培养箱中,加湿气氛为5%CO2。
- 根据商业手册,在转导日(第 0 天)估计细胞并计算达到 5、5 和 3 的目标感染倍数 (MOI) 所需的每个病毒的体积(即 KOS MOI = 5、hc-Myc MOI = 5、hKlf4 MOI = 3)。
- 在37°C水浴中解冻三个仙台管5~10s,并将三个仙台管的计算出体积加到1mL的成纤维细胞介质(材料表)。
- 从步骤 2.3 中取出成纤维细胞介质,并将重新编程的病毒混合物添加到包含细胞的井中。在37°C的培养箱中孵育细胞过夜,其加湿气氛为5%CO2。
- 转导后24小时用新鲜的成纤维细胞介质更换介质。每隔一天用中等交换将细胞培养一周。
- 在转导后第7天收获受感染的小鼠成纤维细胞,使用0.05%胰蛋白酶/EDTA,放在以前涂有纤维蛋白和0.2%明胶的菜肴上。
- 在37°C培养箱中培养从步骤2.6开始感染的小鼠成纤维细胞,使用完整的小鼠胚胎干细胞(ES)生长培养基(材料表),其加湿气氛为5%CO2,每天改变介质。
- 从第8天开始,每隔一天在倒置显微镜下观察板块,用小鼠ES的形态识别细胞团状的外观。
3. 使用碱性磷酸酶活染色和流式细胞测量来量化重新编程效率
- 从每个井中取出培养介质,用 DMEM/F-12 冲洗 2⁄3 分钟。
- 在粘附细胞中应用2 mL的1x碱性磷酸酶(AP)活染色工作溶液(DMEM/F-12中的1:500稀释),并在37°C培养箱中孵育,加湿气氛为5%CO2,30分钟。
- 吸出 AP 活污渍,用 PBS 洗涤两次,每次 5 分钟。
- 在37°C的培养箱中用细胞分离溶液(材料表)消化细胞,加湿气氛为5%CO25分钟。进行流式细胞测定以确定重新编程效率。
4. 选择和收获类似ES的细胞
- 在倒置显微镜下检查步骤 2.8 中的菌落。
- 使用自墨对象标记标记盘子底部的菌落。
- 应用涂有油脂的克隆环覆盖标记的细胞菌落。在37°C下向每个克隆环加入100μL的0.05%胰蛋白酶/EDTA,持续5分钟,然后将具有100μL移液器尖端的消化细胞转移到含有mES生长培养基的48孔培养板。
- 在37°C的培养箱中孵育48孔培养板中的细胞,其加湿气氛为5%CO2。当细胞达到70%汇合时,将细胞转移到6厘米的盘中。
- 重复步骤 4.3 和 4.4 多次,直到获得均匀的宿舍形克隆。
5. 冷冻iPSC进行冷冻保存
- 将所选 iPSC 与胰蛋白酶、西辛和小鸡血浆(TVP;材料表)在 5%CO2培养箱中 37°C 溶液,30 分钟。
- 在无菌的15 mL锥形管中收集细胞,在室温下以217 x g离心3分钟。
- 吸出上清液,在2mL的小鼠ES冷冻培养基(材料表)中重新悬浮细胞颗粒,以获得每冷冻1 mL。
- 将细胞添加到冷冻室,并使用冷冻容器进行冷冻,在-80°C过夜时提供冷冻保存所需的关键-1°C/min冷却速率。
- 将冷冻小瓶转移到液氮罐中。
6. iPSC中干细胞标记的免疫荧光染色
- 步骤 5.1 中的种子 iPSC 用 mES 培养成 8 井室幻灯片,以适当的密度涂覆聚D-莱辛/层宁(材料表),以每口井达到 1⁄2 x 104个细胞,并在 37 °C 培养箱中孵育,加湿大气 5% CO2 48 小时。
- 在室温下将幻灯片浸入 4% 甲醛中 15 分钟,然后每次将幻灯片浸入 PBS 中两次 5 分钟。
- 用小鼠IgG阻断试剂(材料表)孵育部分,在室温下孵育5%山羊血清1小时。
- 稀释蛋白质稀释剂中的主要抗体(小鼠抗SSEA1,1:100,兔抗纳米,1:500;兔防POU类5类主箱1[OCT4],1:500;兔防SRY盒2[SOX2],1:500;兔-反林-28同源A[Lin28A],1:400表材料)。将抗体涂在细胞上,在4°C的加湿室中孵育过夜。
- 丢弃原抗体溶液,在 PBS 中清洗幻灯片 3x。
- 在 M.O.M. 蛋白稀释剂中涂抹第二抗体(Alexa488-结合山羊抗小鼠抗体和 Alexa555-结合山羊抗兔,每次 1:400),并在室温下孵育 45 分钟。
- 在 PBS 中清洗幻灯片 3x,并安装包含 4'6-二酰胺-2-phenyinole (DAPI) 的安装介质部分。
- 使用共聚焦显微镜拍照。
7. 调查iPSC在体内的多能性
- 在37°C的培养箱中,使用TVP溶液将iPSC从步骤5.1分离成单个细胞,在5%CO2的潮湿环境中,30分钟。
- 使用血球计和离心机在217 x g下计数细胞3分钟。
- 在1.5 mL无菌离心管中吸出上清液,用mES培养基重新悬浮颗粒,浓度为5 x 105细胞/30μL,用于细胞移植。
- 使用剪发器去除免疫缺陷小鼠的后肢的头发。
- 用氯胺酮(100毫克/千克)麻醉小鼠,用75%酒精清洁注射部位。
- 使用31G针将步骤7.3的iPSC悬浮液从肌肉内注入胃内。
- 注射两周后,收获小鼠胃肠,并嵌入最佳切割温度(OCT)化合物,捕捉冻结,切成5μm部分15,16。
- 在室温下将部分甲醛固定15分钟,然后在PBS中清洗两次,每次5分钟。
- 在室温下用5%山羊血清蛋白稀释剂阻断细胞1小时。
- 将稀释的原抗体(兔抗AFP,1:50;兔抗SMA,1:50;兔抗TH,1:50)加入幻灯片,并在4°C的加湿室中孵育。
- 丢弃原抗体溶液,在PBS中清洗细胞3倍(5分钟/洗),加入1:400稀释的Alexa555-结合山羊抗兔抗体到幻灯片,并在室温下孵育45分钟。
- 在 PBS 中清洗幻灯片 3 倍(5 分钟/次),并安装包含 DAPI 的安装介质部分。
8. CRISPR/Cas9慢病毒载体的构建,以肌营养不良症外显子为靶向的内创体23
- 设计两对gRNA寡聚物,通过http://crispor.tefor.net/crispor.py瞄准内侧肌侧肌营养不良症23。
注: 设计对如下:
i22感知: 5' -CACCG塔加特塔格阿塔亚卡 -3'
i22 反感: 5' -AAACTTATATTAGCAAC-3'
i23 感知: 5' -CACCGAGTAGTGTATATATCT- 3'
i23 抗感: 5'-AAACAAGAGATATATATATACC-3')。 - 消化和脱磷5μg的慢病毒CRISPR质粒(扁豆-CRISPRv2-爆炸[莫汉巴布的礼物]和扁豆-指南-HyrfP-iRFP670[克里斯汀·布伦南德的礼物])(材料表)与BsmB1/Esp3I在37°C下30分钟。对于5μg质粒,加入3μL的BsmB1限制酶,3μL的快速碱性磷酸酶,6μL的10x酶消化缓冲液和0.6μL的100mM DTT在60μL反应中。
- 将反应加载到0.8%的甘蔗凝胶上。在 100~150 V 下运行凝胶 30 分钟。
- 使用凝胶提取试剂盒(材料表)在凝胶提取试剂盒(材料表)中纯化消化质粒,在20μL的H2 O中洗净。
- 磷酸酯和退火每对gRNA寡核苷酸,每对寡核苷酸含有1μL,每寡核苷酸在100μM,1μL的10xT4结扎缓冲液,0.5μL的T4多核苷酸激酶(PNK),6.5 μL的ddH2O在37°C30分钟,然后95°C为5分钟,然后95°C为5分钟在 5°C/min 时,可自至 25°C。
- 将退火gRNA寡核苷酸稀释1:200稀释到plentiCRISPR V2-Blast或plentiGuide-HyrfP670中。将 50 ng 的 BsmB1/Esp3I 消化载体与 1 μL 的稀释寡核双工和 5 μL 的 2x 利带酶缓冲液加 1 μL 的利带酶混合在 11 μL 反应系统中,并在室温下孵育 10 分钟。
- 根据制造商的说明,使用3μL的结扎产物进行转化为50μL的合格细胞(材料表)。
- 将转化的合格细胞涂在琼脂板中,使用100μg/mL卡比西林,在31.5°C孵育18小时。
- 在 5 mL 的极棒汤(材料表)中,在 31.5 °C 下,在摇床培养箱中,在 185 rpm 的摇床培养箱中,在 100 μg/mL 中,在 10 μg/mL 中挑选具有 10 μL 无菌移液器吸头和培养物的菌落。
- 使用微型制备和中皮准备试剂盒(材料表)纯化质粒DNA。
- 通过限制消化验证小原生质粒。对于20μL反应系统,加入1μg质粒DNA、2μL的消化反应缓冲液(材料表)和1μL的限制性酶混合物(0.5 μL的KpnI-HF和0.5 μL的AgeI-HF,用于plentiCRISPR V2-Blast-i22;0.5 μL的NotI-HF和0.5 μL的EcoRI-HF 普伦蒂指南-海格罗-iRFP670-i23)。在37°C下孵育反应系统1小时。
- 将反应加载到0.8%的甘蔗凝胶上。在 100~150 V 下运行凝胶 30 分钟。
注: plentiCRISPR V2-Blast-i22 的正确频段应为 622 bp 和 12.2 kb,而 plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23 的正确频段应为 2.6 kb 和 7.1 kb。
9. 伦蒂病毒载体包装
- 培养 7 x 105 293FT 细胞在 5 mL 的 DMEM 培养基中含有 10% 胎儿牛血清,在 6 厘米的盘中过夜,在 37°C, 5% CO2.
- 在100μL的血清MEM培养基中制备鸡尾酒(1 μg plentiCRISPR V2-Blast-i22 或 plentiGuide-hyrfP-hygro-hyr-hyr-i23,750 ng psPAX2 包装质粒,250 ng pMD2.G 包络质粒,5 μL 转染试剂 A [材料表] 。
- 在100μL减少的血清MEM培养物中制备5μL转染试剂B(材料表)的混合物。
- 从步骤9.2向质粒混合物中加入100μL转染试剂B混合物,并在室温下孵育5分钟。
- 将DNA-脂质复合物(从步骤9.4)滴到293FT细胞中。在37°C下孵育过夜,CO2为5%。
- 第二天将病毒生产增强剂(500x)(材料表)添加到每道菜中,并在37°C下孵育24小时,CO2为5%。
- 在接下来的两天内,使用移液器从细胞中收集培养基,并通过0.45 μm过滤器过滤培养基以去除细胞。
10. 慢病毒载体的浓度和纯化
- 在步骤 9.7 的培养基中沉淀慢病毒载体,在 4°C 下过夜,含有 5x 聚乙烯乙二醇 4000(PEG4000,8.5% 最终浓度)和 4 M NaCl(0.4 M 最终浓度)。
- 将含有PEG4000溶液的病毒介质在2,095 x g和4°C下离心30分钟,取出并丢弃上清液。
- 用500 μL血清减少MEM培养基(扁豆病毒尼特:扁豆-CRISPR V2-gRNAi22:1.56 x 108,慢透i-iRFP67)重新悬浮颗粒 0-gRNAi23: 1.3 x 108, 慢比-CRISPR V2 控制: 3.13 x 107, 慢比-iRFP670-控制: 5.9 x 107).储存在-80°C,直到使用。
11. 在鼠标 iPSC 中删除外大子 23,同时使用两个导引 RNA (gRNA) 与 Cas9
- 在涂有纤维蛋白和明胶的 24 孔板中,将鼠标 iPSC 从步骤 4.5 中镀上。
- 细胞达到50%汇合后,切换到含有8μg/mL聚苯乙烯的新鲜培养基(完全小鼠胚胎干细胞生长培养基)。
- 从步骤10.3添加100 μL的慢病毒颗粒溶液,包括慢透-CRISPR V2-gRNAi22、慢比-iRFP670-gRNAi23和控制(空载体:慢比-CRISPR V2、慢比-iRFP670)到小鼠iPSC。在37°C下孵育细胞3天,CO2为5%。
- 通过确定杀死未感染细胞所需的沙地霉素和湿霉素B的最小浓度,选择含有2.5微克/mL高血酸和100μg/mL血霉素B的培养基的受感染细胞。
注:未感染的细胞将被高霉素和湿霉素B杀死。 - 用0.5 mL的TVP溶液(24孔板)消化选定的小鼠iPSC,并在37°C下孵育细胞30分钟,CO2为5%。
- 通过移液将iPSC分离成单个细胞,用细胞计数室计数细胞,然后稀释约150个消化的单个细胞,用mES培养成10厘米的培养皿,在37°C下培养,CO2为5%。
- 大约 10 天后,使用 10 μL 无菌移液器吸头在倒置显微镜下挑选单个菌落(需要挑选 96 个菌落)。
- 将采摘的菌落转移到50μL的TVP溶液中,每口井(96孔板,每孔一个菌落),在37°C下消化30分钟,然后将消化的细胞播种成两个96孔培养板以保持培养(一个用于基因分型)。
- 在37°C的CO2孵化器中孵育,直到70%汇合。
12. 使用外向23删除的iPSC菌落的识别
- 当细胞菌落达到70%汇合时,去除96孔板中的介质。
- 在每个孔中加入含有蛋白酶K溶液(100 mL的赖斯兰试剂中1mL蛋白酶K)的赖沙试剂(材料表),并将解液转移到96孔PCR板。
- 密封 PCR 板并在 55°C 孵育板 30 分钟,然后在 95°C 下孵育 45 分钟,使细胞解毒并变性蛋白酶 K。
- 使用步骤12.3的2μL的莱沙进行PCR反应。对于20μL PCR反应,加入2μL的莱沙,10μL的2xDNA聚合酶预混合(材料表),7μL的无DNase水,和1μL的DMD外生23引物(表1)。
- PCR 反应使用以下参数:98 °C 1 分钟,35°C 周期 98°C 10 s,60 °C 15 秒,72°C 用于 30 秒,在 72°C 下最终延长 1 分钟。
- 将 PCR 反应加载到 2% 胶合凝胶上。在 100~150 V 下运行凝胶 30 分钟。
- 在紫外线下检查凝胶(挖空效率为 3/94)。
13. 使用Tet-on肌D活化系统将iPSC直接分化为肌原祖细胞(MPC)
- 包装 LV-TRE-VP64-鼠标 MyoD-T2A-dsRedExpress2 和 LV-TRE-VP16 鼠标 MyoD-T2A-dsExpress2(查尔斯·格斯巴赫的礼物) (材料表),如前面描述的慢透-CRISPRv2-爆炸和扁豆-gRNA-iRFP670矢量部分9 和 10。
- 用慢病毒 iPSC 感染慢病毒-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 或慢病毒-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2,如前面描述的慢病毒-CRISPRv2-爆炸和慢比-gRNA-iRFP670载体,步骤11.1_11.3中。
- 在感染三天后选择1μg/mL紫霉素的细胞,以获得纯转导细胞群。
- 在培养基中加入3微克/mL多氧环素(10%FBS DMEM),以增强MPC差异化。每两天更换一次用多西环素补充的新鲜介质。
14. 定量逆转录PCR,用于评估动态肌肉分化和DMD外大22-24表达
- 使用RNA分离试剂在多西环素处理0、3、6和10天后提取细胞RNA,使用第一链cDNA合成试剂(材料表)反向将RNA转录到cDNA中。
- 对于20μL qPCR反应系统,加入1μL的cDNA,10μL的PCR反应缓冲液(材料表),8μL的DNAH2O,和1μL的正向和反向引物混合物(甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH],骨骼肌[ACTA1],OCT4 和 DMD exon22、DMD exon23 和 DMD exon24,参见表 1。
- PCR 反应使用以下参数:50 °C 2 分钟,95 °C 2 分钟,40 循环 95 °C 15 s,60 °C 1 分钟,熔体曲线 65.0 °C 至 95.0 °C,增量 0.5 °C。
15. 肌苷重链2(MYH2)和肌营养不良蛋白表达的免疫荧光染色
- 板多西环素诱导,扁豆-TRE-MyoD修饰细胞从步骤13.4到8孔培养幻灯片。
- 在室温下将细胞固定在4%甲醛中15分钟,然后在PBS中清洗两次,每次5分钟。
- 在室温下用5%山羊血清蛋白稀释剂阻断细胞1小时。
- 在幻灯片中加入兔抗营养不良素抗体(1:300)和小鼠抗MYH2抗体(1:100),在4°C的加湿室中孵育过夜。
- 丢弃原抗体溶液,在PBS中清洗细胞3倍(5分钟/洗),加入1:400稀释的Alexa488-偶联山羊抗兔抗体和Alexa555-结合山羊抗小鼠抗体到幻灯片,并在室温下孵育45分钟。
- 在 PBS 中清洗幻灯片 3 倍(5 分钟/洗),并安装包含 DAPI 的安装介质部分。
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Representative Results
建立Dmdx皮肤成纤维细胞衍生iPSC。 我们使用无集成的重新编程载体,演示了从Dmdmdx小鼠衍生的皮肤成纤维细胞生成小鼠iPSC的效率。图1A表明,胚胎干细胞(ESC)样菌落在感染后三周出现。通过活碱性磷酸酶(AP)染色评估iPSC诱导效率;图1B显示,根据FACS分析,AP阳性细胞的百分比约为1.8%。SSEA1、Lin28、Nanog、OCT4和SOX2是小鼠胚胎干细胞的多能标记物,通过免疫荧光染色对iPSC菌落呈阳性(图1C)。为了研究iPSC在体内的三种生殖系分化,我们肌肉内将iPSC注射到小鼠胃内。我们观察到注射的iPSCs分化成肝细胞(内分体)、平滑肌细胞(中生代)和肾上腺素神经元细胞(脑膜)(图1D),说明iPSCs的多能性。
CRISPR/Cas9介导的exon23删除。我们设计了两个引导RNA,在突变体外质23的侧翼。在Cas9介导的双链断裂(DSB)和非同源端连接(NHEJ)后,突变外源23被删除,允许截断但功能性营养不良症的产生(图2A)。为了识别外置23删除的小鼠iPSC,细胞被稀疏播种,并挑选和繁殖单个菌落。从这些菌落中提取的基因组DNA进行PCR基因分型。图2B显示,殖民地#1和#2有外显子23删除表明成功删除外显子23。
将小鼠 iPSC 区分为肌源系并恢复肌营养不良蛋白表达。我们使用四环素诱导肌D表达系统诱导iPSCs的肌基分化。多西环素用于诱导iPSC中的肌D表达。图3A显示了多克斯治疗的iPSC中肌肉分化的时间过程。qRT-PCR显示,多能标记物OCT4的mRNA水平逐渐降低,而骨骼肌标记ACTA1的表达在多克斯诱导后增加。此外,我们观察到在多克斯治疗后两周的近管形成(图3B)。重要的是,qRT-PCR测定显示DMD外显子24mRNA表达在Dox诱导,Cas9介导的Exon23删除线相比,Cas9控制线(图3C)的恢复。与qRT-PCR不一致,免疫荧光染色显示营养不良蛋白表达在Cas9介导的外显子23删除细胞,而营养不良蛋白表达在控制细胞中不存在(图3D)。
图1:将Dmdx小鼠的皮肤成纤维细胞重新编程到iPSC中。
(A) ES 样菌落的代表性图像(刻度柱 = 200 μm)。(B) FACS分析小鼠皮肤成纤维细胞在仙台病毒通过活AP染色转导8天后重新编程到iPSC中的编程效率。(C) iPSC 中 SSEA1、Lin28、Nanog、Oct4 和 SOX2 的免疫荧光染色(刻度杆 = 50 μm)。(D) 在 iPSC 注射到胃内米 (刻度棒 = 20 μm) 后 2 周,对 BAY (内分泌)、SMA (中代)和酪氨酸水解 (TH) (异端)的免疫荧光染色。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:CRISPR/Cas9介导的外向23删除。
(A) CRISPR/Cas9介导的外子23删除的原理图。Cas9核酸酶的目标是22号,23号,两个gRNA。Cas9 的双链断裂 (DSB) 导致突变外源 23 的切除。远端由非同源端连接(NHEJ)修复,从而恢复肌营养不良症基因的阅读框架。(B) 排外23的PCR基因分型分析.箭头表示外大23的PCR产物。GAPDH作为参考。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:将小鼠iPSC区分为肌源系,恢复肌营养不良蛋白表达。
(A) qRT-PCR 显示 Dox 处理的外显子 23 删除 Dmdmdx iPSC 中 mRNA 水平 10 月 4 和 ACTA1 的时间过程(*P < 0.05 vs D0, D6, D10, #P < 0.05 vs D0, D3, D10, $P < 0.05 vs D0, D3, D6, n = 4 10 月 4) (+P < 0.05 vs D6 和 D10#P < 0.05 vs D0、D3 和 D10,$P < 0.05 vs D0、D3 和 D6,n = 3 表示 ACTA1)。(B) 左图:多克斯诱导小鼠 iPSC (刻度柱 = 200 μm) 的肌管形成的代表性图像。右图:多克斯诱导小鼠iPSC(刻度杆 = 20 μm)对肌管形成中的MYH2进行免疫荧光分析。(C) 上部:DMD Exon22、Exon23 和 Exon24 的 PCR 引基位置;底部:对MPC中DMD Exon22、Exon23和Exon24表达的mRNA水平的qRT-PCR分析(*P < 0.0001,n = 3)。(D) iPSCCas9-Ctrl和 iPSCCas9-gRNA (刻度棒 = 50 μm) 多克斯诱导 MPC 中的营养不良蛋白表达的免疫荧光分析。请点击此处查看此图的较大版本。
导引 | |
i22 感 | 5'-CACCGAGCTTATAAATCAA- 3' |
i22 反义 | 5'-AAACTATATATAGCAC-3' |
i23 感 | 5'-CACCGAGATATGTCTCT- 3' |
I23 反义 | 5' - AAACAAGATATACACATACTC-3' |
PCR 引漆 | |
OCT4-前进 | 5'-AGCTGCAGAAAGGATCA-3' |
OCT4-反向 | 5' - TCTCATTGTCGTTCTCCCC-3' |
ACTA1-前进 | 5' - 加特加加加加加ACAC-3' |
ACTA1-反向 | 5'-TAGAGACCAGAGAGAGTACAT-3' |
Exon22-转发 | 5'-塔卡卡加GCTATCA-3' |
Exon22-反向 | 5'-CCGAGCTCTCCTATTTC-3' |
Exon23-转发 | 5'-中国国家加 大AAAAAAGCAAAAATAtG-3' |
Exon23-反向 | 5' - TGGGCTTTCCACCA-3' |
Exon24-转发 | 5' - AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3' |
Exon24-反向 | 5'-TTTCAGATATCCC-3' |
GAPDH-前进 | 5' - TGAAAGCTCTCTCTCTCTG-3' |
GAPDH-反向 | 5' - CCCTCATACCCTC-3' |
表1:底漆序列。
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Discussion
杜琴肌肉萎缩症(DMD)是一种破坏性的,最终致命的遗传性疾病,其特征是缺乏营养不良症,导致渐进性肌肉萎缩1,2。我们的结果表明,通过CRISPR/Cas9介导的外显23缺失方法,Dmdmdx iPSC衍生的造血原细胞中恢复了营养不良蛋白基因表达。这种方法有三个优点。
首先,我们使用非集成RNA载体从Dmdmdx小鼠衍生的皮肤成纤维细胞中生成iPSC。已经开发出各种方法来生成iPSCs,如慢病毒和逆转录病毒载体,它们将集成到宿主染色体中,以表达重新编程的基因,从而引起安全问题。基于DNA的载体,如质粒载体、腺相关病毒和腺病毒以非整合方式存在;然而,它们仍可能以低频集成到宿主染色体中。在这项研究中,我们使用一种经过修饰的、不可传播的仙台病毒(一种非整合的RNA载体)安全有效地将干细胞转录因子输送到成纤维细胞,以便重新编程。
接下来,我们使用CRISPR介导的基因组删除,而不是CRISPR/Cas9介导的精确基因校正,以恢复iPSC中的营养不良蛋白表达。该方法可行、有效;它很容易设计多个gRNA删除多个突变外子,这发生在许多人类DMD患者17。Exon删除利用一个相对有效的非同源端连接通路,该方法也避免了提供DNA修复模板的需要。因此,与Cas9介导的精密校正相比,Cas9介导外子缺失适用于具有多个基因突变的DMD患者。
最后,将未分化的iPSC诱导到肌原原代细胞中,降低iPSC引起的肿瘤发生风险。在这个协议中,我们通过诱导四环素调节(Tet-On)矢量系统诱导MyoD表达,将iPSCs分化为骨骼肌祖体18,19。
总之,CRISPR/Cas9基因组编辑与Tet-on MyoD活化系统的结合,可为DMD患者细胞移植干细胞中突变DMD-Exon23的缺失提供一个安全、可行、有效的策略。
为了有效地选择和收获类似ES的细胞,我们应该通过圆顶状形态来识别未分化的iPSC细胞,墨迹对象标记可以帮助我们从培养皿底部标记单个克隆,在iPSC周围有一个1.8毫米的圆圈克隆。为了避免胰蛋白酶溶液泄漏,我们需要均匀地将润滑脂涂在环的底部。此外,在将涂有润滑脂的环放在标记的细胞菌落的顶部后,应小心不要触摸环。否则,iPSC 克隆将被分离。
该协议有其局限性;例如,我们选择了一个非集成RNA载体系统来生成iPSC。然而,我们使用慢病毒CRISPR/Cas9系统删除DMD外源23和基于慢病毒的MyoD激活系统诱导iPSC肌源分化;这些综合慢病毒载体有安全问题。然而,这些问题可以通过应用一种核糖核蛋白(RNP)复合物来解决,该复合物包括重组、高纯度的S.pyogenesCas9核酸酶与crRNA:tracrRNA双相;我们可以选择化学修饰的MyoD mRNA转染,直接将iPSCs分化为肌基原代,尽管效率可能具有挑战性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
唐和温特劳布部分得到NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Instruments | |||
31-gauge needle | Various | ||
Sharp Incision | Various | ||
Sterile Scalpels | Various | ||
Tweezers | Various | ||
Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
AgeI-HF | NEB | R3552L | |
Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
CutSmart | NEB | B7204S | |
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
KpnI-HF | NEB | R3142L | |
lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
NotI-HF | NEB | R3189L | |
Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
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