تحليل ميرنا اندماجي علاجات لتنظيم دورة الخلية والأوعية
Summary
المداواة ميرنا لديها إمكانات كبيرة في تنظيم تطور السرطان. أثبت هنا النهج التحليلية تستخدم لتحديد النشاط لعلاج ميرنا اندماجي في وقف دورة الخلية والأوعية.
Abstract
سرطان الرئة (LC) هو السبب الرئيسي للوفيات المتصلة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. مماثلة لغيرها من الخلايا السرطانية، سمات أساسية للخلايا LC هو الانتشار غير المنظم وانقسام الخلية. تثبيط الانتشار بوقف تقدم دورة الخلية قد ثبت أن يكون نهجاً واعداً لعلاج السرطان، بما في ذلك قانون العمل.
المداواة ميرنا قد برزت بوصفها المنظمين الجينات بوستترانسكريبشونال هام ومتزايد وتجري الآن دراسة لاستخدامها في علاج السرطان. أننا استخدمت في الأعمال الأخيرة، ميرناس اثنين، مير-143 ومير-506، لتنظيم دورة الخلية التقدم. تم transfected الخلايا السرطانية (NSCLC) الرئة الخلية غير الصغيرة A549، تم تحليل التعديلات التعبير الجيني، وأخيراً وقد تم تحليل نشاط أبوبتوتيك بسبب العلاج. تم الكشف عن دوونريجوليشن من cyclin تعتمد على مؤنزم (كدكس) (أي، CDK1، CDK4 و CDK6)، وتوقف دورة الخلية في التحولات المرحلة G1/S و G2/M. وأظهر تحليل مسار نشاط الأوعية المحتملة للعلاج، مما يمنح هذا النهج مع نشاط متعدد الأوجه. هنا، يتم وصف المنهجيات المستخدمة لتحديد النشاط ميرنا فيما يتعلق بتثبيط دورة الخلية، وتنظيم دورات تعريفية للمبرمج، وآثار العلاج على خلايا بطانية بتثبيط تولد الأوعية. من المؤمل أن الأساليب المعروضة هنا سيدعم البحوث في المستقبل على المداواة ميرنا والنشاط المقابلة وأن بيانات تمثيلية سيرشد الباحثين الآخرين خلال التحليلات التجريبية.
Introduction
دورة الخلية هو مزيج من الأحداث التنظيمية المتعددة التي تسمح بالازدواجية في انتشار الحمض النووي والخلية عن طريق عملية الانقسامية1. تعتمد على cyclin مؤنزم (كدكس) تنظيم وتعزيز دورة الخلية2. فيما بينها، قد CDK الانقسامية (CDK1) والطور البيني كدكس (CDK2 و CDK4 و CDK6) دوراً محوريا في تطور دورة الخلية3. هو فوسفوريلاتيد البروتين الشبكية (الميزانية العادية) بمجمع CDK4/CDK6 للسماح بتقدم دورة الخلية4، وتفعيل CDK1 أمر ضروري لنجاح انقسام الخلية5. تم تطوير العديد CDK مثبطات وتقييمها في التجارب السريرية على مدى العقود القليلة الماضية، مما يشير إلى إمكانية استهداف كدكس في علاج السرطان. في الواقع، تمت الموافقة على ثلاثة CDK مثبطات لعلاج سرطان الثدي مؤخرا6،،من78،،من910. وهكذا، كدكس، وعلى وجه الخصوص، CDK1 و CDK4/6، ذات أهمية كبيرة في تنظيم تطور سرطان الخلية.
ميرناس (ميرس) يتم الكشف الصغيرة، غير الترميز والمنظمين بوستترانسكريبشونال التعبير الجيني، وتنظيم ما يقرب من 30 في المائة من جميع الجينات البشرية11. يستند نشاطها القمع متعدية أو تدهور رسول الكشف (مرناس)12. توضيحية لأهميتها البيولوجية، تم تحديد أكثر من 5,000 ميرناس ويمكن تنظيم جزيء ميرنا وحيدة متعددة الجينات11،13. الأهم من ذلك، ارتبط تعبير ميرنا من أمراض مختلفة، وحالات المرض، بما في ذلك السرطان13. في الواقع، قد اتسمت ميرناس كما النمطان أو المكثفات الورم، قادرة على تعزيز أو قمع الورم التنمية والتقدم14،15. ويمكن تنظيم التعبير النسبي عن ميرناس في الأنسجة المريضة تطور المرض؛ وهكذا، تسليم خارجية ميرناس إمكانات علاجية.
سرطان الرئة السبب الرئيسي للوفيات الناجمة عن السرطان وأكثر من 60 في المائة من جميع الأورام الخبيثة في الرئة غير الصغيرة خلايا الرئة السرطان16،17، مع معدل البقاء على قيد الحياة 5 سنوات أقل من 20%18. تم تقييم استخدام مير-143-3 ف وف مير-506-3 مؤخرا لاستهداف دورة الخلية في خلايا سرطان الرئة11. مير-143 ومير-506 متواليات التي التكامل بين CDK1 و CDK4/CDK6، وتم تحليل آثار هذه ميرس اثنان على خلايا A549. تفاصيل تجريبية تعرض وتناقش في هذه الورقة. تم تقييم التعبير الجيني، وتقدم دورة الخلية، والمبرمج استخدام تصاميم تجريبية مختلفة وتيميبوينتس عقب تعداء. كنا في الوقت الحقيقي الأساليب الكمية بكر (RT-qPCR) جنبا إلى جنب مع تحليل ميكرواري لقياس التعبير الجيني محددة، واستخدمت الجيل التالي تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد الجينات العالمية التقلبات11. ويحدد طريقة الأخيرة الوفرة النسبية لنسخة كل مورثة مع حساسية عالية وإمكانية تكرار نتائج، بينما آلاف جينات يمكن أن تحلل من تحليل تجريبي واحد. بالإضافة إلى ذلك، أنجز تحليل أبوبتوتيك بسبب العلاج ميرنا ويرد هنا. المعلوماتية الحيوية استكمال تحليل المسار. المقدمة هنا هي البروتوكولات المستخدمة لتحليل العلاجية المحتملة من اندماجي مير-143 ومير-506.
والغرض الرئيسي من هذا البروتوكول تحديد آثار ميرناس في الخلايا، مع تركيز على دورة الخلية. مجموعة متنوعة التقنيات المقدمة هنا تمتد من تحليل التعبير الجيني قبل الترجمة (باستخدام qPCR) لوضع ورواية تقنيات لتحليل الجينات على مستوى البروتين، مثل تحليل ميكرواري. ونأمل أن هذا التقرير مفيد للباحثين المهتمين بالعمل مع ميرناس. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم منهجية لتحليل تدفق سيتوميتريك دورة الخلية والمبرمج للخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميرناس يمكن أن تعمل كالعلاجات الموجهة لعلاج السرطان، وإذ تسلم بالتقلبات مستويات التعبير في المريضة مقابل أنسجة طبيعية. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد ميرناس التي يحتمل أن تكون وقف تقدم دورة الخلية خلال مراحل متعددة. وقد حددت أن مير-143 و 506 مير وقف دورة الخلية من الخلايا السرطانية، والبروتوكول?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تعريف لا تضارب في المصالح.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
- Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
- Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
- Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
- Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
- Mullard, A. FDA approves Novartis’s CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
- Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
- Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
- Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
- Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
- Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Biologie du développement. 302 (1), 1-12 (2007).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
- Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. . Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
- Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
- Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
- Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
- Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, 21 (2013).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).
