Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis
Summary
miRNA la terapéutica tienen un potencial significativo en la regulación de la progresión del cáncer. Demostrado aquí son enfoques analíticos utilizados para la identificación de la actividad de un miRNA combinatoria tratamiento en detener el ciclo celular y la angiogénesis.
Abstract
Cáncer de pulmón (LC) es la causa principal de muertes relacionadas con cáncer en todo el mundo. Similares a otras células de cáncer, una característica fundamental de las células del LC es la proliferación no regulada y la división celular. Inhibición de la proliferación por detener la progresión del ciclo celular ha demostrado ser un enfoque prometedor para el tratamiento de cáncer, incluyendo LC.
terapéutica de miRNA se han convertido en reguladores del gen postranscripcional importante y cada vez más están siendo estudiados para su uso en el tratamiento del cáncer. En trabajos recientes, se utilizaron dos miRNAs, miR-143 y miR-506, para regular la progresión del ciclo celular. Células de cáncer (CPCNP) de pulmón de células no pequeñas A549 fueron transfectadas, alteraciones de expresión del gene fueron analizados y finalmente se analizó la actividad apoptótica debido al tratamiento. Downregulation de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) fueron detectados (CDK1, CDK4 y CDK6), y ciclo celular se detiene en las transiciones de fase G1/S y G2/M. Análisis de la vía indican potencial actividad angiogénica del tratamiento, que dota el enfoque de actividad multifacética. Aquí se describe son las metodologías utilizadas para identificar la actividad del miRNA con respecto a la inhibición del ciclo celular, inducción de apoptosis y efectos del tratamiento sobre las células endoteliales por la inhibición de la angiogénesis. Se espera que los métodos presentados aquí apoyará investigaciones futuras sobre terapéutica de miRNA y la actividad correspondiente y que los datos representativos guiará a otros investigadores en análisis experimentales.
Introduction
El ciclo celular es una combinación de varios eventos regulatorios que permiten la duplicación del ADN y proliferación celular mediante el proceso mitótico1. Quinasas Ciclina-Dependientes (CDKs) regularan y promoción el ciclo celular2. Entre ellos, el CDK mitótica (CDK1) y la interfase CDKs (CDK2, CDK4 y CDK6) tienen un papel fundamental en el ciclo celular avance3. Proteína del retinoblastoma (Rb) es fosforilada por la CDK4/CDK6 complejos para permitir de la progresión del ciclo celular4y activación de CDK1 es esencial para la exitosa División de la célula5. Numerosos inhibidores de CDK se han desarrollado y evaluado en ensayos clínicos durante las últimas décadas, indicando el potencial de dirigirse las CDKs en tratamiento contra el cáncer. De hecho, tres inhibidores de CDK han sido aprobados para el tratamiento del cáncer de mama recientemente6,7,8,9,10. Así, las CDKs, y en particular, CDK1 y CDK4/6, son de gran interés en la regulación de la progresión del cáncer de la célula.
miRNAs (miRs) son pequeños, no-codificación RNAs y reguladores postranscripcional de la expresión génica, regulación de aproximadamente 30% de todos los genes humanos11. Su actividad se basa en la represión de translación o degradación del mensajero RNAs (mRNAs)12. Ilustrativo de su significación biológica, se han identificado más de 5.000 miRNAs y una molécula de miRNA solo puede regular múltiples genes11,13. Lo más importante, expresión de miRNA se ha asociado con diferentes enfermedades y Estados de enfermedad, incluyendo cáncer13. De hecho, miRNAs se han caracterizado como oncogénicos o supresores de tumor, siendo capaz de promover o suprimir el tumor y14,15. La expresión relativa de miRNAs en los tejidos enfermos puede regular progresión de la enfermedad; así, el suministro exógeno de miRNAs tiene potencial terapéutico.
Cáncer de pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer y más de 60% de todas las malignidades pulmonares son pequeñas células de pulmón cáncer16,17, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 20%18. El uso de miR-143-3 p y p de miR-506-3 fue evaluado recientemente para apuntar los ciclos celulares de las células de cáncer de pulmón11. miR-143 y miR-506 tienen secuencias complementariedad CDK1 y CDK4/CDK6, y se analizaron los efectos de estos dos miRs en células A549. Los datos experimentales se presentan y discuten en este documento. Expresión génica, la progresión del ciclo celular y la apoptosis fueron evaluadas utilizando diferentes diseños experimentales y los puntos de tiempo después de transfección. Se utilizaron los métodos PCR (RT-qPCR) cuantitativos en tiempo real junto con el análisis de microarrays para medir la expresión de genes específicos, y secuenciación de próxima generación RNA se utilizó para determinar gen global dysregulation11. El último método identifica la abundancia relativa de transcripción de cada gen con alta sensibilidad y reproducibilidad, mientras que miles de genes pueden ser analizadas desde un único análisis experimental. Además, análisis de apoptosis por miRNA tratamiento fue realizada y se describen aquí. Bioinformática complementa el análisis de la vía. Presentados aquí son protocolos utilizados para análisis del terapéutico potencial de la combinatoria de miR-143 y miR-506.
El objetivo principal de este protocolo es identificar los efectos de los miRNAs en células, con un enfoque en el ciclo celular. La variedad de técnicas presentadas aquí útil de análisis de expresión génica novela y traducción antes (usando qPCR) para la elaboración de técnicas para el análisis del gene en el nivel de proteína, tales como análisis de microarrays. Se espera que este informe es útil para los investigadores interesados en trabajar con miRNAs. Además, se presenta una metodología para el análisis cytometric del flujo del ciclo celular y apoptosis de las células.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs pueden operar como terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer, reconociendo la desregulación de los niveles de expresión en enfermos vs los tejidos normales. Este estudio pretende determinar miRNAs que potencialmente detener la progresión del ciclo celular en varias etapas. Se identificó que el miR-143 y miR-506 detener el ciclo celular de las células cancerosas y los protocolos presentados se pretende comprender la actividad de este tratamiento de miRNA combinatoria.
Las m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
No se declaran conflictos de interés.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
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