असंदर्भित प्रशांत ऑयस्टर्स से एक वस्तुतः अनुक्रमित cDNA लाइब्रेरी के उत्पादन के लिए एक Converging रणनीति
Summary
हम कैसे unreferenced प्रशांत सीप नमूनों से आरएनए नमूनों का उपयोग करने के लिए एक रणनीति का वर्णन है, और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जीनोम डेटा के साथ तुलना द्वारा आनुवंशिक सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए एक वस्तुतः अनुक्रम CDNA पुस्तकालय उत्पन्न करते हैं.
Abstract
संदर्भ प्रजातियों की जैविक सामग्री के लिए उपयोग, जो पहले प्रमुख प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था जैसे कि उपन्यास सेल लाइनों या जीनोम अनुक्रमण परियोजनाओं के विकास में, अक्सर आगे के अध्ययन या तीसरे पक्ष के कारण प्रदान करने के लिए मुश्किल है नमूनों की उपभोक् ता प्रकृति। हालांकि अब व्यापक रूप से एशिया, ऑस्ट्रेलिया और उत्तरी अमेरिका के प्रशांत तटों पर वितरित, व्यक्तिगत प्रशांत सीप नमूने आनुवंशिक रूप से काफी विविध हैं और इसलिए जीन पुस्तकालयों के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में सीधे उपयुक्त नहीं हैं. इस अनुच्छेद में, हम क्षेत्रीय समुद्री भोजन बाजार से प्राप्त unreferenced प्रशांत सीप नमूनों के उपयोग का प्रदर्शन करने के लिए cDNA पुस्तकालयों उत्पन्न करते हैं. इन पुस्तकालयों तो सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सीप जीनोम की तुलना में थे, और निकटतम संबंधित पुस्तकालय mitochondrial संदर्भ जीन Cytochrome C Oxidase subunit मैं (COX1) और NADH Dehydrogenase (एनडी) का उपयोग कर चुना गया था. उत्पन्न cDNA पुस्तकालय की उपयुक्तता भी क्लोनिंग और दो जीन की अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शित किया जाता है एंजाइमों यूडीपी-ग्लूकुरोनिक एसिड dehydrogenase (UGD) और UDP-xylose synthase (UXS), जो से UDP-xylose के biosynthesis के लिए जिम्मेदार हैं एन्कोडिंग यूडीपी-ग्लूकोज।
Introduction
लंबे समय तक वितरण समय, उद्यमी तर्क, या देश-विशिष्ट सीमा शुल्क नियमों के कारण रहने वाले संदर्भित जैविक सामग्री का अधिग्रहण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। एक विकल्प के रूप में, आवश्यक जैविक सामग्री भी phenoically समान नमूनों से एकत्र किया जा सकता है. हालांकि, इन नमूनों जीनोटाइप के स्तर पर काफी भिन्न हो सकते हैं, और इसलिए एक ही प्रजाति के डिजिटल रूप से संग्रहीत संदर्भ जीनोम के साथ तुलना अक्सर मुश्किल या यहां तक कि नए स्रोत सामग्री की असंगति के कारण व्यर्थ प्रदान की जाती हैं मौजूदा डीएनए प्रवर्धन विधियों. व्यक्तिगत नमूनों की अत्यधिक संरक्षित जीन ों को अलग-अलग1 प्रजातियों की पहचान करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और शक्तिशाली उपकरण है , इस तरह के संरक्षित mitochondrial जीन है कि अक्सर cDNA पुस्तकालयों की गुणवत्ता के आकलन के लिए संदर्भ जीन के रूप में उपयोग किया जाता है के रूप में2 ,3,4,5,6. इसके साथ प्रस्तुत विधि के लिए अंतर्निहित तर्क यह है कि संदर्भ जीनोम के इसी दृश्यों की तुलना में व्यक्तिगत अनाम सीप नमूनों में mitochondrial जीन दृश्यों के उच्च संरक्षण इंगित करता है कि अन्य जीन भी एक दिखा सकते हैं विचलन के निम्न स्तर, परमाणु डीएनए7के सापेक्ष mitochondrial डीएनए विकास की आम तौर पर तेजी से दर को देखते हुए, बस सार्वजनिक रूप से उपयोग करके वैज्ञानिक और औद्योगिक रूप से प्रासंगिक जीन की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रवर्धन और अलगाव की अनुमति एक संदर्भ के रूप में उपलब्ध अनुक्रमण डेटा.
यहाँ वर्णित विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक वस्तुतः अनुक्रम सीप CDNA पुस्तकालय जो सीप जीन की क्लोनिंग के लिए टेम्पलेट डीएनए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता पैदा करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह पेश है. आभासी अनुक्रमण में, डे नोवो जीनोम अनुक्रमण दरकिनार है; इसके बजाय, एक ज्ञात, डिजिटल संग्रहीत संदर्भ अनुक्रम का उपयोग या cDNAs है कि अंततः एक पुस्तकालय शामिल होगा के उत्पादन के लिए प्राइमर डिजाइन करने के लिए सीधे प्रयोग किया जाता है (या एक पूर्व मौजूदा एक करने के लिए जोड़ा जाएगा). उद्देश्य एक अभिसरण CDNA पुस्तकालय का उत्पादन करने के लिए है, जिसका अर्थ है कि उत्पन्न cDNA दृश्यों और संदर्भ अनुक्रम के बीच समानताएं कम से उच्च विचलन के लिए स्थान दिया जा सकता है. साइटोक्रोम सी ऑक्सिडेज सबयूनिट 1 (COX1) और NADH Dehydrogenase (एनडी) संदर्भ जीन के रूप में उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ यह है कि इन माइटोकोंड्रियाल जीनों के उच्च संरक्षण के कारण भी अत्यधिक भौगोलिक रूप से विक्षिप्यता सीप नमूनों को प्रोफाइल किया जा सकता है। इन अच्छी तरह से स्थापित मार्करों के साथ दृष्टिकोण साबित करने के बाद, हम तो दो एंजाइम उम्मीदवारों जो चीनी न्यूक्लिओटाइड biosynthesis में शामिल हैं और औद्योगिक प्रासंगिकता का हो सकता है के लिए अपने आवेदन का प्रदर्शन8,9, 10. प्रशांत सीप की जैव-प्रौद्योगिकी क्षमता अभी भी अज्ञात है . इस प्रकार, हम मानते हैं कि एक वस्तुतः अनुक्रम cDNA पुस्तकालय तैयार करने के लिए इस converging विधि भी गैर विशेषज्ञ शोधकर्ताओं जो इस प्रासंगिक जैविक सामग्री से cDNA उत्पन्न करना चाहते हैं के लिए उपयुक्त हो जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सीप डीएनए जीनोम डेटाबेस के साथ COX1 और एनडी जीन की तुलना से क्षेत्रीय समुद्री भोजन बाजार से इसी तरह phenotype के साथ unreferenced सीप नमूनों की आनुवंशिक पहचान की अनुमति दे?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31471703, A0201300537 और 31671854 जे.वी. और एल.एल., अनुदान संख्या 31470435 को जी.वाई.) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और 100 विदेशी प्रतिभा योजना (जेएसबी2014012 को अनुदान)।
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
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