Una estrategia convergente para la generación de una biblioteca de ADNc virtualmente secuenciada a partir de ostras del Pacífico sin referencia
Summary
Describimos una estrategia para utilizar muestras de ARN de muestras de ostras del Pacífico sin referencia, y evaluamos el material genético en comparación con los datos del genoma disponibles públicamente para generar una biblioteca de ADNc virtualmente secuenciada.
Abstract
El acceso al material biológico de las especies de referencia, que se utilizaron anteriormente en experimentos clave, como en el desarrollo de nuevas líneas celulares o proyectos de secuenciación del genoma, a menudo son difíciles de proporcionar para estudios adicionales o terceros debido a la carácter consintontivo de las muestras. Aunque ahora se distribuyen ampliamente en las costas del Pacífico de Asia, Australia y América del Norte, los especímenes individuales de ostras del Pacífico son genéticamente muy diversos y, por lo tanto, no son directamente adecuados como material de partida para bibliotecas de genes. En este artículo, demostramos el uso de especímenes de ostras del Pacífico sin referencia obtenidos de los mercados regionales de mariscos para generar bibliotecas de ADNc. Estas bibliotecas se compararon entonces con el genoma de la ostra disponible públicamente, y la biblioteca relacionada más cercana fue seleccionada utilizando los genes de referencia mitocondrialCón C Oxidase subunit I (COX1) y NADH Dehydrogenase (ND). La idoneidad de la biblioteca de ADNc generada también se demuestra mediante la clonación y expresión de dos genes que codifican las enzimas UDP-glucurónica acid deshidrogenasa (UGD) y UDP-xilosa sintasa (UXS), que son responsables de la biosíntesis de UDP-xilosa de UDP-glucosa.
Introduction
La adquisición de material biológico vivo al que se hace referencia puede ser difícil debido a largos plazos de entrega, razonamiento empresarial o regulaciones aduaneras específicas de cada país. Como alternativa, el material biológico requerido también puede recogerse de muestras fenotípicamente idénticas. Sin embargo, estas muestras pueden variar significativamente a nivel de genotipo, y por lo tanto las comparaciones con genomas de referencia almacenados digitalmente de la misma especie a menudo se hacen difíciles o incluso inútiles debido a la incompatibilidad del material de nueva fuente con métodos de amplificación de ADN existentes. La secuenciación de genes altamente conservados de muestras individualeses una herramienta ampliamente utilizada y poderosa para identificar la especie 1, como los genes mitocondriales conservados que se utilizan con frecuencia como genes de referencia para la evaluación de la calidad de las bibliotecas de ADNc2 ,3,4,5,6. La razón subyacente para el método aquí presentado es que la alta conservación de las secuencias genéticas mitocondriales en muestras de ostras anónimas individuales en comparación con las secuencias correspondientes del genoma de referencia indica que otros genes también pueden mostrar una bajo nivel de divergencia, dada la tasa generalmente más rápida deevolución del ADN mitocondrial en relación con el ADN nuclear 7, lo que permite la amplificación y el aislamiento de una amplia gama de genes científica e industrialmente relevantes simplemente utilizando públicamente datos de secuenciación disponibles como referencia.
El objetivo general del método aquí descrito es presentar un flujo de trabajo optimizado para generar una biblioteca de ADNc de ostras virtualmente secuenciada que se puede utilizar como ADN de plantilla para la clonación de genes de ostras. En la secuenciación virtual, se elude la secuenciación del genoma de novo; en su lugar, una secuencia de referencia conocida y almacenada digitalmente se utiliza directamente para utilizar o diseñar imprimaciones para la producción de cDNA que finalmente comprenderán una biblioteca (o se agregarán a una preexistente). El objetivo es producir una biblioteca convergente de ADNc, lo que significa que las similitudes entre las secuencias de ADNc generadas y la secuencia de referencia se pueden clasificar de baja a alta divergencia. Una ventaja clave del uso de la subunidad 1 del citocromo C Oxidasa (COX1) y nadh deshidrogenasa (ND) como genes de referencia es que incluso los especímenes de ostras altamente disyuntos geográficamente pueden ser perfilados debido a la alta conservación de estos genes mitocondriales. Habiendo demostrado el enfoque con estos marcadores bien establecidos, demostramos su aplicación a dos candidatos a enzimas que participan en la biosíntesis de nucleótidos de azúcar y pueden ser de relevancia industrial8,9, 10. El potencial biotecnológico de la ostra del Pacífico aún no está explorado. Por lo tanto, creemos que este método convergente para la preparación de una biblioteca de ADNc prácticamente secuenciada también será adecuado para los investigadores no especializados que quieren generar ADNc a partir de este material biológico relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado permite la identificación genética de muestras de ostras sin referencia con fenotipo similar de los mercados regionales de mariscos en comparación con los genes COX1 y ND con una base de datos de genoma de ADN de ostra disponible públicamente. La importancia de este método radica en su simplicidad, ya que sólo se necesita una sola reacción de PCR para la evaluación de la biblioteca virtual de ADNc. Los dos genes mitocondriales COX1 y ND conservados se amplificaron a partir de una bibliotec…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Ciencias Naturales de China (números de concesión 31471703, A0201300537 y 31671854 a J.V. y L.L., otorgar el número 31470435 a G.Y.), y el Plan de Talentos Extranjeros 100 (número de concesión JSB2014012 a J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
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