Een convergerende strategie voor het genereren van een virtueel Gesequentieerde cDNA-Bibliotheek van niet-gerefereerde Pacifische oesters
Summary
We beschrijven een strategie voor het gebruik van RNA-monsters van niet-gerefereerde Pacifische oester specimens en evalueren het genetische materiaal in vergelijking met openbaar beschikbare genoom gegevens om een virtueel gesequentieerde cDNA-Bibliotheek te genereren.
Abstract
De toegang tot biologisch materiaal van referentie soorten, die voorheen werden gebruikt in belangrijke experimenten zoals bij de ontwikkeling van nieuwe cellijnen of genoom volgorde projecten, zijn vaak moeilijk te voorzien voor verdere studies of derden als gevolg van de het verbruik van de monsters. Hoewel de individuele Pacifische oester specimens nu op grote schaal over de Pacifische kusten van Azië, Australië en Noord-Amerika verdeeld zijn, zijn ze genetisch vrij divers en daarom niet direct geschikt als uitgangsmateriaal voor genbibliotheken. In dit artikel demonstreren we het gebruik van niet-gerefereerde Pacifische oester specimens verkregen van regionale vismarkten om cDNA-bibliotheken te genereren. Deze bibliotheken werden vervolgens vergeleken met het publiek beschikbare oester genoom, en de dichtstbijzijnde gerelateerde bibliotheek werd geselecteerd met behulp van de mitochondriale referentie genen cytochroom C oxidase subeenheid I (COX1) en NADH dehydrogenase (ND). De geschiktheid van de gegenereerde cDNA-Bibliotheek wordt ook aangetoond door het klonen en de expressie van twee genen die de enzymen UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) coderen en UDP-xylose synthase (UXS), die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese van UDP-xylose van UDP-glucose.
Introduction
De overname van biologisch materiaal waarnaar wordt verwezen, kan een uitdaging zijn als gevolg van lange levertijden, ondernemende redenering of landspecifieke douanevoorschriften. Als alternatief kan het vereiste biologisch materiaal ook worden opgevangen uit fenotypisch identieke specimens. Deze monsters kunnen echter aanzienlijk variëren op het niveau van genotype, en daarom worden vergelijkingen met digitaal opgeslagen referentie-genoom van dezelfde soort vaak moeilijk of zelfs nutteloos als gevolg van onverenigbaarheid van het nieuw geproduceerde materiaal met bestaande DNA-versterkings methoden. Sequentiëren van sterk gecondengeerde genen van individuele monsters is een veelgebruikte en krachtige tool voor het identificeren van soorten1, zoals gecondengeerde mitochondriale genen die vaak worden gebruikt als referentie genen voor de kwaliteitsbeoordeling van cDNA-bibliotheken2 ,3,4,5,6. De achterliggende gedachte voor de hierin gepresenteerde methode is dat een hoog behoud van mitochondriale gensequenties in individuele anonieme oester monsters ten opzichte van de corresponderende sequenties van het referentie genoom aangeeft dat andere genen ook een lage mate van divergentie, gezien de over het algemeen snellere snelheid van mitochondriale DNA-evolutie ten opzichte van nucleair DNA7, waardoor de versterking en isolatie van een breed scala aan wetenschappelijk en industrieel relevante genen door simpelweg het gebruik van openbare beschikbare sequentiegegevens als referentie.
Het algemene doel van de hierin beschreven methode is het presenteren van een geoptimaliseerde workflow voor het genereren van een vrijwel geordend Oyster cDNA-bibliotheek die kan worden gebruikt als template-DNA voor het klonen van oester genen. In virtuele sequentiëren wordt de Novo genoome-sequencing omzeild; in plaats daarvan wordt een bekende, digitaal opgeslagen referentie sequentie direct gebruikt om primers te gebruiken of te ontwerpen voor de productie van Cdna’s die uiteindelijk een bibliotheek zullen omvatten (of worden toegevoegd aan een reeds bestaande). Het doel is om een convergente cDNA-Bibliotheek te produceren, wat betekent dat overeenkomsten tussen de gegenereerde cDNA-sequenties en de referentie volgorde kunnen worden gerangschikt van laag naar hoog divergentie. Een belangrijk voordeel van het gebruik van cytochroom C oxidase subeenheid 1 (COX1) en NADH dehydrogenase (ND) als referentie-genen is dat zelfs zeer geografisch nieuwe oester specimens kunnen worden geprofileerd als gevolg van het hoge behoud van deze mitochondriale genen. Nadat we de aanpak met deze gevestigde markers hebben bewezen, tonen we vervolgens de toepassing ervan aan twee enzym kandidaten die betrokken zijn bij de biosynthese van suiker nucleotide en die van industrieel belang kunnen zijn8,9, 10. het biotechnologische potentieel van de Pacifische oester is nog niet verkend. Daarom zijn wij van mening dat deze convergerende methode voor de voorbereiding van een virtueel gesequentieerde cDNA-Bibliotheek ook geschikt zal zijn voor niet-gespecialiseerde onderzoekers die cDNA van dit relevante biologische materiaal willen genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol maakt de genetische identificatie mogelijk van niet-gerefereerde oester specimens met soortgelijk fenotype van regionale vismarkten door vergelijking van de COX1-en ND-genen met een publiekelijk beschikbare oester-DNA-genoom-database. Het belang van deze methode ligt in zijn eenvoud, omdat er slechts één PCR-reactie nodig is voor de evaluatie van de virtuele cDNA-Bibliotheek. De twee geconjugeerde mitochondriale COX1 en ND-genen werden versterkt uit een cDNA-bibliotheek die werd gegenereerd …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels gesteund door de Natural Science Foundation van China (Grant nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 tot J.V. en ll, grantnummer 31470435 tot G.Y.) en het 100 buitenlands talenten plan (subsidie nummer JSB2014012 aan J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market. Food Control. 90, 199-204 (2018).
- Zhang, H., et al. Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).
- Sell, J., Spirkovski, Z. Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation. Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).
- Karadjian, G., et al. Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).
- Morga, B., et al. Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR. Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).
- Delsuc, F., et al. Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).
- Wei, S., et al. Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila. Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).
- Gu, B., et al. Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus. Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).
- Duan, X. C., et al. Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- Song, H. B., et al. UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).
- Gainey, P. A., Phelps, C. F. Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans. Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).
