استراتيجية متقاربة لتوليد مكتبة cDNA التسلسل تقريبا من المحار المحيط الهادئ غير المشار إليها
Summary
ونحن نصف استراتيجية لكيفية استخدام عينات الحمض النووي الريبي من عينات المحار المحيط الهادئ غير المشار إليها، وتقييم المواد الوراثية بالمقارنة مع بيانات الجينوم المتاحة للجمهور لتوليد مكتبة cDNA تسلسل تقريبا.
Abstract
غالباً ما يكون من الصعب توفير المزيد من الدراسات أو الأطراف الثالثة بسبب تطوير خطوط الخلايا الجديدة أو مشاريع تسلسل الجينوم، والتي كانت تستخدم في السابق في التجارب الرئيسية مثل تطوير خطوط الخلايا الجديدة أو مشاريع تسلسل الجينوم. الطبيعة الاستهلاكية للعينات. وعلى الرغم من أن عينات المحار الفردية في المحيط الهادئ موزعة الآن على نطاق واسع على سواحل المحيط الهادئ في آسيا وأستراليا وأمريكا الشمالية، فإنها متنوعة جينيا ً جداً وبالتالي فهي غير مناسبة مباشرة كمادة بداية لمكتبات الجينات. في هذه المقالة، نبين استخدام عينات المحار المحيط الهادئ غير المشار إليها التي تم الحصول عليها من أسواق المأكولات البحرية الإقليمية لتوليد مكتبات cDNA. ثم تمت مقارنة هذه المكتبات بجينوم المحار المتاح للجمهور، وتم اختيار أقرب مكتبة ذات صلة باستخدام الجينات المرجعية الميتوكوندريا Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) وNADH Dehydrogenase (ND). وتتجلى ملاءمة مكتبة cDNA التي تم إنشاؤها أيضا عن طريق استنساخ والتعبير عن اثنين من الجينات ترميز الإنزيمات UDP-glucuronic حمض dehydrogenase (UGD) وUDP-xylose synthase (UXS)، والتي هي المسؤولة عن التركيب البيولوجي من UDP-xylose من UDP-الجلوكوز.
Introduction
وقد يكون الحصول على المواد البيولوجية الحية المشار إليها تحديا ً بسبب طول فترات التسليم، أو منطق تنظيم المشاريع، أو الأنظمة الجمركية الخاصة بكل بلد. وكبديل لذلك، يمكن أيضا جمع المواد البيولوجية المطلوبة من عينات متطابقة فيفيوالعادة. ومع ذلك، قد تختلف هذه العينات بشكل كبير على مستوى النمط الجيني، وبالتالي فإن المقارنات مع الجينومات المرجعية المخزنة رقمياً من نفس الأنواع غالباً ما تصبح صعبة أو حتى عديمة الجدوى بسبب عدم توافق المواد المصدرة حديثاً مع طرق تضخيم الحمض النووي الموجودة. تسلسل الجينات المحفوظة للغاية من العينات الفردية هو أداةتستخدم على نطاق واسع وقوية لتحديد الأنواع 1، مثل الجينات الميتوكوندريا المحفوظة التي تستخدم في كثير من الأحيان كجينات مرجعية لتقييم جودة مكتبات cDNA2 ،3،4،5،6. الأساس المنطقي للطريقة المعروضة هنا هو أن الحفظ العالي لتسلسلات الجينات الميتوكوندريا في عينات المحار الفردية المجهولة مقارنة بالتسلسلات المقابلة للجينوم المرجعي يشير إلى أن الجينات الأخرى قد تظهر أيضًا انخفاض مستوى الاختلاف، نظرا لمعدل أسرع عموما من تطور الحمض النووي الميتوكوندريا بالنسبة للحمض النوويالنووي7، مما يسمح تضخيم وعزل مجموعة واسعة من الجينات ذات الصلة علميا وصناعيا ببساطة باستخدام علنا بيانات التسلسل المتوفرة كمرجع.
الهدف العام للطريقة الموصوفة هنا هو تقديم سير عمل محسن لتوليد مكتبة cDNA المحار تسلسل تقريبا التي يمكن استخدامها كقالب الحمض النووي لاستنساخ جينات المحار. في التسلسل الظاهري، يتم التحايل على تسلسل الجينوم دي نوفو؛ بدلاً من ذلك، يتم استخدام تسلسل مرجعي معروف ومخزن رقمياً مباشرة لاستخدام أو تصميم التمهيديات لإنتاج cDNAs التي ستضم في نهاية المطاف مكتبة (أو تضاف إلى مكتبة موجودة من قبل). والهدف من ذلك هو إنتاج مكتبة cDNA متقاربة، مما يعني أن أوجه التشابه بين تسلسلات cDNA المتولدة والتسلسل المرجعي يمكن ترتيبها من الاختلاف المنخفض إلى العالي. ميزة رئيسية لاستخدام السيتوكروم C Oxidase الوحدة الفرعية 1 (COX1) وNADH Dehydrogenase (ND) كجينات مرجعية هو أنه حتى عينات المحار المفككة جغرافيا للغاية يمكن أن تكون شخصية بسبب الحفاظ على عالية من هذه الجينات الميتوكوندريا. بعد أن أثبتت النهج مع هذه العلامات الراسخة، ثم نثبت تطبيقه على اثنين من المرشحين الإنزيم التي تشارك في التركيب الحيوي النيوكليوتيد السكر، ويمكن أن تكون ذات صلة صناعية8،9، 10– ولا تزال الإمكانات التكنولوجية الأحيائية لمحار المحيط الهادئ غير مستكشفة. وبالتالي، نعتقد أن هذه الطريقة المتقاربة لإعداد مكتبة cDNA التسلسل تقريبا ستكون مناسبة أيضا للباحثين غير المتخصصين الذين يرغبون في توليد cDNA من هذه المواد البيولوجية ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويسمح البروتوكول المعروض بالتعرف الجيني على عينات المحار غير المشار إليها ذات النمط الظاهري المماثل من أسواق المأكولات البحرية الإقليمية بالمقارنة مع جينات كوكس1 وND مع قاعدة بيانات جينوم الحمض النووي للالمحار المتاحة للجمهور. تكمن أهمية هذه الطريقة في بساطتها، حيث لا يلزم سوى رد فعل PCR و…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل جزئيا مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 31471703 و A0201300537 و 31671854 إلى J.V. و L.L.، والمنحة رقم 31470435 إلى G.Y.)، وخطة المواهب الأجنبية 100 (رقم المنحة JSB2014012 إلى J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market. Food Control. 90, 199-204 (2018).
- Zhang, H., et al. Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).
- Sell, J., Spirkovski, Z. Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation. Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).
- Karadjian, G., et al. Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).
- Morga, B., et al. Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR. Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).
- Delsuc, F., et al. Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).
- Wei, S., et al. Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila. Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).
- Gu, B., et al. Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus. Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).
- Duan, X. C., et al. Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- Song, H. B., et al. UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).
- Gainey, P. A., Phelps, C. F. Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans. Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).
